Un test pour l’étude de la phagocytose induite par le récepteur Fcγ dans les monocouches de monocytes

Commencez par les globules rouges, ou GR.

Ajouter des anticorps polyclonaux spécifiques aux antigènes de surface des globules rouges.

couver. Les anticorps opsonisent les globules rouges en les enrobant par une liaison spécifique aux antigènes de surface.

Centrifugez et retirez les anticorps non liés.

Ajoutez les globules rouges opsonisés par anticorps en suspension à une lame à plusieurs chambres contenant des monocouches de monocytes. Couver.

Les récepteurs gamma Fc de surface sur les monocytes se lient à la région Fc des anticorps polyclonaux liés aux globules rouges.

Cette liaison provoque l’agrégation du récepteur Fc autour de la zone de contact et déclenche une signalisation intracellulaire, entraînant une réorganisation du cytosquelette d’actine dans les monocytes.

Ce réarrangement du cytosquelette induit l’extension des pseudopodes et crée une coupe phagocytaire autour des globules rouges opsonisés.

La cupule phagocytaire renferme progressivement les globules rouges opsonisés, conduisant à leur engloutissement complet dans un phagosome délimité par une membrane.

Après l’incubation, laver la lame avec un tampon pour éliminer les globules rouges non phagocytés. Fixez les cellules.

Montez la diapositive à l’aide d’un support de montage.

Effectuez une microscopie à contraste de phase pour visualiser et quantifier les globules rouges phagocytés dans les monocytes.

Pour opsoniser les globules rouges R₂R₂, lavez d’abord les globules rouges trois fois dans du PBS. Diluer la pastille R₂R₂ après la troisième centrifugation dans un rapport de un pour un avec des anticorps polyclonaux anti-D du sérum humain pour une incubation d’une heure à 3 degrés Celsius avec mélange intermittent. À la fin de l’opération, retirez les cellules de l’incubateur, puis lavez-les trois fois de plus dans du PBS comme nous venons de le démontrer.

Remettez la pastille en suspension à 1,25 % de volume à volume dans un milieu RPMI complet. Ensuite, remplacez le surnageant de chaque puits de la lame à huit chambres par 400 microlitres de cellules R₂R₂ opsonisées pendant deux heures à 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, utilisez les adaptateurs de lames pour retirer les chambres, en tamponnant l’excédent de R₂R₂ avec une serviette en papier.

Maintenant, remplissez un bécher de 100 millilitres de PBS et trempez lentement chaque lame 30 à 40 fois dans la solution saline pour éliminer la majorité du R₂R₂ non phagocyté. Après le séchage, fixez les lames dans du méthanol à 100 % pendant 45 secondes et laissez sécher les cellules avant de monter les échantillons avec des lamelles.

Le lendemain, chargez chaque lame sur un microscope à contraste de phase avec une lentille d’objectif 40x, et comptez manuellement au moins 200 monocytes et le nombre de R₂R₂ phagocytés dans chaque monocyte à l’aide d’un compteur dans chaque main pour quantifier simultanément le nombre de monocytes et le nombre de cellules R₂R₂ phagocytes par échantillon.