Mesure de l’alloréactivité dans une population mixte de lymphocytes T

Commencez avec une plaque multipuits contenant des cellules dendritiques de souris, ou CD portant des alloantigènes ou des variantes génétiques d’auto-antigènes.

Introduire des lymphocytes T de souris, y compris des lymphocytes T alloréactifs qui ne réagissent pas aux auto-antigènes, tout en reconnaissant les antigènes étrangers.

Les lymphocytes T alloréactifs reconnaissent ces alloantigènes et interagissent avec les DC, déclenchant le réarrangement du cytosquelette, y compris la réorganisation de l’actine F.

Cela favorise les récepteurs des lymphocytes T à s’engager avec des molécules co-stimulatrices sur les CD, formant une connexion cellulaire – une synapse immunologique.

Fixez les cellules, transférez-les dans un tube et introduisez un cocktail d’anticorps marqués au fluorochrome spécifiques aux récepteurs des lymphocytes T et des DC Lymphocytes, conférant une fluorescence distincte.

Retirez les anticorps non liés et remettez les cellules en suspension dans un tampon contenant un agent perméabilisant qui perméabilise les cellules et des marqueurs protéiques verts marqués au fluorophore qui se lient à l’actine F.

Centrifugez et mettez à nouveau en suspension les cellules dans un tampon contenant un colorant nucléaire, colorant les noyaux en rouge.

À l’aide de la cytométrie en flux d’imagerie, identifiez les doublets – correspondant aux conjugués des lymphocytes T et des DC avec un réticule vert de l’actine F – confirmant la formation des synapses.

Quantifier les doublets représentant le degré d’alloréactivité.

Commencez par ensemencer 0,5 fois 10 à la sixième cellule dendritique dans chaque puits d’une plaque de culture cellulaire de 96 puits, puis 1 fois 10 à la sixième cellule T dans un volume final pouvant atteindre jusqu’à 50 microlitres au total de milieu de culture par puits. Incuber les cultures froides pendant quatre heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Ensuite, ajoutez trois fois le volume de culture de formaldéhyde à 1,5 % dans du PBS dans chaque puits pendant 30 minutes à température ambiante. À la fin de la fixation, transférez les cellules de chaque puits dans un tube en polystyrène correspondant de 5 millilitres et colorez les cellules avec les anticorps conjugués au fluorochrome appropriés dans 100 microlitres de tampon de lavage pendant 30 minutes à température ambiante, à l’abri de la lumière.

Ensuite, lavez les cellules dans 1 millilitre de tampon de lavage et mettez les granulés en suspension dans un tampon de lavage permanent contenant de la phalloïdine-FITC. Après 30 minutes supplémentaires à température ambiante à l’abri de la lumière, lavez les cellules dans 1 millilitre de tampon de lavage frais permanent. Remettez les pastilles en suspension dans le colorant nucléaire d’intérêt dans le tampon de lavage permanent pour une incubation finale de 30 minutes à température ambiante à l’abri de la lumière, et lavez les cellules dans 1 millilitre de tampon de lavage permanent, suivi d’un lavage dans le tampon de lavage seul. Ensuite, mettez les cellules en suspension dans 50 à 100 microlitres de tampon de lavage frais et transférez les cellules dans des tubes de microcentrifugation à petit capuchon.

Pour analyser les interactions de cellule à cellule, réservez d’abord un canal pour l’acquisition d’images en fond clair et chargez le premier tube de contrôle. Lorsque le canal fond clair est désactivé, dans la fenêtre Espace de travail, créez un nouveau nuage de points pour chaque canal utilisé avec le rapport d’aspect sur la zone et placez les singlets là où le rapport d’aspect est proche de un.

Pour chaque fluorochrome, vérifiez la population positive et ajustez la tension laser dans le boîtier d’éclairage si nécessaire. Dans la zone Canaux, sélectionnez les canaux appropriés pour les fluorochromes utilisés dans la coloration. Cliquez ensuite sur Enregistrer. Lorsque le nombre d’événements atteint le seuil spécifié, l’acquisition s’arrête automatiquement.

Une fois que tous les contrôles de coloration unique ont été acquis, chargez le premier tube d’échantillon expérimental et acquérez plusieurs dizaines de milliers d’événements sous les canaux d’analyse appropriés, y compris le canal en fond clair.