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Immunologie
0 vues • 3:03 min • July 8th, 2025
Commencer avec une plaque multi-puits contenant un liquide de lavage broncho-alvéolaire de souris comprenant une population de cellules immunitaires colorées avec un colorant fluorescent vert.
Introduire des anticorps Fc pour bloquer les récepteurs Fc des cellules immunitaires.
Ajoutez un cocktail d’anticorps distincts marqués au fluorophore ciblant des marqueurs cellulaires spécifiques. Retirez les anticorps non liés et remettez les cellules en suspension dans un tampon.
À l’aide de la cytométrie en flux, identifiez les singulets à faible fluorescence, indiquant les cellules vivantes.
Illuminer les cellules à 488 nanomètres, ce qui fait que les cellules émettent une fluorescence rouge corrélée aux cellules exprimant CD11c.
Au sein de la population CD11c élevée, avec des filtres de longueur d’onde appropriés, identifier les protéines marqueurs cellulaires MHC-II sur les cellules dendritiques et SiglecF sur les macrophages.
Dans la population CD11c faible, l’expression de CD3 sur les lymphocytes T et de CD19 sur les lymphocytes B permet leur identification.
Illuminez les cellules à 405 nanomètres, émettant une fluorescence bleue, signifiant les neutrophiles exprimant CD11b.
L’illumination de cellules à 633 nanomètres excite des fluorophores rouges lointains sur les éosinophiles exprimant Ly-6G.
À l’aide des données de cytométrie en flux, énumérez l’abondance de chaque type de cellule immunitaire dans le liquide de lavage broncho-alvéolaire.
Après la troisième collecte de lavage broncho-alvéolaire, centrifugez l’aspiration en grappe et stockez le surnageant à moins 80 degrés Celsius. Remettre la pastille en suspension dans 200 microlitres de tampon de lyse ACK. Après pas plus de deux minutes à température ambiante, diluez le tampon de lyse avec un millilitre de PBS froid et collectez les cellules par centrifugation.
Remettre la pastille en suspension dans le volume approprié de PBS pour le nombre d’échantillons à analyser et aliquoter les cellules dans le nombre approprié de puits d’une plaque de 96 puits pour l’analyse. Récupérez les cellules par une autre centrifugation, et remettez les granulés en suspension dans 50 microlitres de bloc FC dans du PBS.
Après 10 minutes à température ambiante, ajoutez 50 microlitres du cocktail d’anticorps d’intérêt approprié à chaque puits et incubez les cellules pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation, centrifugez la plaque et jetez le surnageant, en remettant les pastilles en suspension jusqu’à un volume final de 200 microlitres de tampon FACS par puits pour l’analyse cytométrique en flux.