JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 vues • 6:08 min • July 8th, 2025
Prenez une plaque multi-puits contenant des mycobactéries. Ajouter des concentrations croissantes de composés d’essai dans les puits.
couver. Selon l’action du composé sur les mycobactéries, il peut soit inhiber la croissance mycobactérienne, montrant une activité bactériostatique, soit éliminer les mycobactéries, démontrant une activité bactéricide.
Transférez les aliquotes de puits dans une microplaque de gélose à gésazurine au charbon de bois, ou CARA, contenant de la gélose avec du charbon actif pour absorber le composé d’essai, évitant ainsi les effets de rémanence.
couver. L’activité bactériostatique du composé inhibe la réplication mycobactérienne, tandis que l’activité bactéricide réduit la viabilité mycobactérienne.
Ajoutez un tampon, de la résazurine et un tensioactif non ionique pour disperser la résazurine dans les puits.
Chez les mycobactéries métaboliquement actives, les déshydrogénases réduisent la résazurine de couleur bleue et faiblement fluorescente en une résorufine rose et fluorescente.
À l’aide d’un lecteur de microplaques, mesurez la fluorescence de la résoruphine dans les puits.
L’absence de fluorescence de la résorupine indique l’activité bactéricide du composé.
La variation de l’intensité de la fluorescence d’un puits à l’autre indique la charge bactérienne active, ce qui reflète le pouvoir bactéricide ou bactériostatique dépendant de la concentration des composés d’essai.
Inoculer des tubes à centrifuger en polypropylène à fond rond ou conique contenant respectivement 4 ou 20 millilitres de Middlebrook 7H9-ADN ou 7H9-OADC avec M. smegmatis à une DO580 de 0,01 à 0,1. Incuber les cultures de M. smegmatis à 37 degrés Celsius et 20 % O2 en secouant, en étendant les cultures jusqu’à la phase mi-logarithmique ou à une DO580 approximative de 0,5.
Pour mettre en place une expérience de type concentration inhibitrice minimale dans des conditions de réplication et de non-réplication, distribuez 200 microlitres de cellules dans 7H9-ADN à une DO580 de 0,01 dans tous les puits d’une plaque de 96 puits traitée par culture tissulaire à fond clair.
Pour le test non réplicatif, utilisez du PBS contenant 0,02 % de tyloxapol pour laver les cellules deux fois et utilisez un milieu non réplicatif pour remettre les cellules en suspension. Utilisez un milieu non réplicatif pour diluer les cellules à une DO580 de 0,1, et ajoutez du nitrite de sodium à une concentration finale de 0,5 à 5 millimolaires à partir d’un stock de 1 molaire fraîchement préparé.
Distribuer 200 microlitres de cellules à une DO580 de 0,1 dans tous les puits d’une plaque à 96 puits traitée par culture tissulaire à fond clair. Après avoir préparé les agents de test selon le protocole de texte, ajoutez 2 microlitres d’agent de test #1 dans les rangées A à E, et 2 microlitres d’agent de test #2 dans les rangées E à H, et mélangez soigneusement.
Pour reproduire les essais, incuber des microplaques de M. smegmatis à 37 degrés Celsius, 20 % d’O2 et 5 % de CO2 pendant 1 à 48 heures. Aux moments où le CARA sera utilisé comme lecture, utilisez une pipette multicanaux P200 réglée à 50 à 75 microlitres pour remettre soigneusement en suspension le contenu du puits de la plaque de test de type MIC90 en pipetant vers le haut et vers le bas 5 à 10 fois. Ensuite, utilisez les pointes de la pipette pour faire tourbillonner doucement le contenu des puits dans un mouvement circulaire.
Transférez 10 microlitres du contenu non dilué du puits d’analyse dans les puits correspondants de la microplaque CARA, en évitant les éclaboussures pendant les transferts et en veillant à ce que l’aliquote de 10 microlitres soit repérée au milieu des puits de microplaques CARA. À l’aide de ruban adhésif, liez des piles de microplaques CARA, puis placez-les dans un sac en plastique refermable. Incuber les microplaques de M. smegmatis CARA à 37 degrés Celsius avec 20 % d’O2 pendant un à deux jours pour les plaques répliquantes et pendant deux à trois jours pour les plaques non réplicatives.
Lorsqu’un film de croissance bactérienne ou des colonies macroscopiques plus grandes sont visibles dans les puits de contrôle négatif, utilisez un seul ensemble de 12 pointes P200 avec une pipette multicanaux pour distribuer 40 microlitres de PBS stérile le long du côté des puits et laissez le PBS se répartir sur le dessus des microcolonies bactériennes de gélose.
Préparez le réactif de développement CARA en mélangeant 5 milligrammes de résazurine et 50 millilitres de Tween-80 à 5 % dans du PBS. Ajoutez 50 microlitres de réactif de développement CARA fraîchement préparé dans chaque puits de la microplaque CARA. Ensuite, balancez les plaques d’avant en arrière plusieurs fois pour aider à répartir le réactif sur la gélose et le tapis bactérien dans chaque puits. Placez les assiettes dans un sac en plastique refermable et incubez à 37 degrés Celsius pendant au moins 30 minutes pour M. smegmatis.
Avant de lire la fluorescence, placez les microplaques CARA dans une hotte de biosécurité pendant 15 minutes à température ambiante avec les couvercles retirés. Lorsque vous utilisez des spectrophotomètres BSL3 à l’extérieur d’une enceinte de biosécurité, collez un autocollant PCR de qualité optique sur la plaque et utilisez une serviette en papier doux pour sceller hermétiquement en appuyant doucement sur la surface de l’autocollant. Déterminer la fluorescence par lecture supérieure avec excitation à 530 nanomètres et émission à 590 nanomètres.