Encyclopédie des expériences JoVE
Immunologie
0 vues • 4:08 min • July 8th, 2025
Prenez des tubes contenant des macrophages rapporteurs avec le gène de la phosphatase alcaline embryonnaire sécrétée ou de l’enzyme SEAP sous un promoteur inductible.
Dans un tube, introduisez un anticorps spécifique du macrophage Toll-like receptor 2 ou TLR2, neutralisant son activité.
Dans un autre, ajoutez un inhibiteur pour supprimer la signalisation TLR4. Laissez le dernier tube non traité.
Prenez une lame chambrée avec une couche adsorbée de motifs moléculaires associés aux dommages ou DAMP - des protéines libérées lors de la nécrose cellulaire.
Ajouter les macrophages traités et non traités dans des puits séparés et incuber.
TLR2 et TLR4 sur les macrophages non traités se lient aux DAMPs, activant les facteurs de transcription du facteur nucléaire kappa-B, ou NF-κB, et de la protéine activatrice-1, ou AP-1.
Ceux-ci se déplacent vers le noyau et se lient au promoteur de SEAP, régulant à la hausse la production de SEAP, qui est sécrété extracellulairement.
Transférez le surnageant contenant des PAED dans une microplaque avec un substrat chromogène.
Le PAED hydrolyse le substrat, produisant un produit de couleur violet-bleu. Mesurez l’absorbance.
La neutralisation de TLR2 réduit fortement la production de PAED, indiquant que TLR2 est le médiateur principal.
Pour évaluer les effets d’une couche protéique adsorbée sur l’activité NF-kB/AP-1 médiée par un récepteur de type toll, après avoir cultivé des macrophages rapporteurs dans un flacon de taille appropriée jusqu’à une confluence de 70 %, détachez les cellules avec une solution de dissociation enzymatique appropriée, comme démontré.
Remettez les cellules en suspension à une concentration de7,3 x 10 5 cellules par millilitre dans le milieu de dosage et aliquotez-les uniformément entre trois tubes. Traitez le premier tube de cellules avec un microgramme par millilitre d’inhibiteur de TLR4 pendant 60 minutes à température ambiante. Traitez le deuxième tube avec 50 microgrammes par millilitre d’anticorps anti-TLR2 pendant 30 minutes à température ambiante et laissez le troisième tube à température ambiante sans traitement.
Pendant que les cellules sont en incubation, ajoutez 200 microlitres de lysat et 10 % de sérum de veau fœtal dans trois puits collants par condition. Laissez les protéines s’adsorber à 37 degrés Celsius pendant la période expérimentale appropriée avant d’aspirer les solutions protéiques avec une nouvelle pipette Pasteur pour chaque puits, et de laver les surfaces collantes du puits trois fois avec 250 microlitres de PBS par puits, pendant 5 minutes par lavage.
À la fin du traitement par macrophages rapporteurs, ajoutez 200 microlitres de solution cellulaire dans chaque puits. Ajouter Pam3CSK4 à une concentration finale de 150 nanogrammes par millilitre dans deux puits en tant que témoin positif TLR2, comme illustré dans le schéma.
Pour un contrôle TLR4-positif, ajoutez du lipopolysaccharide à une concentration finale de 1,5 microgramme par millilitre dans deux puits. Après 20 heures à 37 degrés Celsius, plaquez 20 microlitres de surnageant de chaque puits en double dans une plaque de 96 puits, y compris trois puits avec 20 microlitres de milieu d’analyse par puits comme le contrôle de fond.
Ensuite, ajoutez 200 microlitres de réactif de test rapporteur SEAP dans chaque puits et couvrez la plaque d’un joint adhésif pour une incubation de 2 heures et demie à 37 degrés Celsius. Transférez le reste du surnageant dans un tube de 1,5 millilitre par puits collant et sédimentez les débris par centrifugation. Ensuite, transférez les surnageants dans de nouveaux tubes de 1,5 millilitre pour un stockage à moins 80 degrés Celsius pour l’analyse en aval des cytokines pro-inflammatoires par ELISA. À la fin de l’incubation, retirez le joint adhésif de la plaque et lisez l’absorbance sur un lecteur de plaques à 635 nanomètres.