Méthode in vitro pour déterminer l’activité anti-apoptotique d’anticorps contre le TNFα

Prenez une plaque multipuits contenant des fibroblastes de souris dans un milieu privé de sérum. Ajoutez des dilutions en série d’anticorps spécifiques du TNFα.

Ajoutez du TNFα - une cytokine inflammatoire.

couver. La privation sérique induit un stress cellulaire, rendant les cellules sensibles à l’apoptose médiée par TNFα.

La

liaison du TNFα à ses récepteurs sur les cellules privées de sérum déclenche des cascades de signalisation intracellulaires, activant la cascade de caspase et induisant l’apoptose.

Cependant, la liaison des anticorps au TNFα empêche sa liaison au récepteur, inhibant ainsi l’activation de la caspase.

Après l’incubation, ajoutez un mélange de réactifs contenant un détergent, un substrat de caspase proluminescent et une enzyme luciférase ainsi que des ions ATP et magnésium. Mélangez et incuber.

Le détergent perméabilise les membranes, libérant des caspases des cellules induites par le TNFα.

Le substrat bioluminescent contient un site de reconnaissance des caspases. Des caspases spécifiques clivent le substrat, générant de l’aminoluciférine.

La luciférase oxyde son substrat, l’aminoluciférine, ce qui entraîne l’émission de lumière.

Mesurer l’intensité de la luminescence pour détecter une baisse de la luminescence avec l’augmentation des concentrations d’anticorps, indiquant la puissance des anticorps spécifiques du TNFα pour neutraliser le TNFα et prévenir l’apoptose induite par le TNFα.

Ajoutez 50 microlitres de suspension cellulaire aux 60 puits internes de la plaque de test, en commençant par la colonne 2 jusqu’à la 11e. Mélanger la suspension cellulaire par pipetage pour ajouter des aliquotes à la microplaque. Transférez immédiatement 50 microlitres des dilutions cartographiées sur la plaque de dosage.

Pour les voies parallèles, distribuer les dilutions en tournant autour de la micropipette. Les dilutions cartographiées peuvent être distribuées dans les puits dans l’ordre suivant. Des contrôles sont dispensés dans les puits environnants.

Diluez le TNF-alpha avec 500 microlitres d’eau ultra-pure. Mélanger par mélangeur vortex à 2 200 tr/min. Transférer dans un tube de 15 ml, et enfin, diluer à 40 nanogrammes par ml avec un milieu de culture d’essai. Distribuez 50 microlitres de la solution d’induction de l’apoptose dans les 60 puits extérieurs internes. Distribuez des microlitres de la solution d’induction de l’apoptose dans les 60 puits de dosage internes. Enfin, incubez pendant 16 heures.

Le cinquième jour, reconstituez le substrat avec sa solution tampon comme indiqué dans les instructions du fabricant. Mélanger en inversant cinq fois. Distribuez la solution de substrat et ajoutez 50 microlitres de solution de substrat à chaque puits d’échantillon dans la plaque de dosage. Ajoutez également du substrat aux commandes. Agitez le test dans un mélangeur vortex à 400 tr/min pendant trois minutes.

Sortez la plaque de dosage du mélangeur et incubez à température ambiante. Allumez un spectrophotomètre à lecteur de plaques. Ouvrez le logiciel Softmax Pro ou tout autre programme équivalent. Chargez la microplaque dans le spectrophotomètre et ajustez les paramètres suivants.

Activez la fonction de luminescence sur le type d’appareil de forage dans la fonction de point final. Ajustez la zone de l’appareil à l’exclusion des colonnes 1 et 12. Sélectionnez le type de plaque pour une microplaque à fond transparent standard de 96 puits. Modifiez le temps d’intégration jusqu’à 1250 millisecondes. Ajustez le temps d’agitation de la microplaque à 10 secondes. Sélectionnez la paroi dans laquelle la substance de référence, la substance analytique et l’échantillon de contrôle seront placés. Commencez à lire.