Un test in vitro basé sur des cellules dendritiques pulsées par vaccin pour induire la prolifération des lymphocytes

Commencez par ajouter les antigènes du vaccin testé à la culture de cellules dendritiques.

La cellule dendritique reconnaît l’antigène, l’internalise via l’endocytose médiée par le récepteur, le fragmente en peptides plus petits et transfère le complexe antigène-CMH résultant à la surface de la cellule pour la présentation.

Co-cultiver des cellules dendritiques présentatrices d’antigène avec des lymphocytes T naïfs pour permettre l’interaction entre le récepteur des lymphocytes T et le complexe antigène-CMH, ainsi que leurs co-récepteurs.

Cela conduit à la formation de synapses immunologiques, activant les lymphocytes T via la signalisation intracellulaire.

Les lymphocytes T activés subissent une expansion clonale, générant des lymphocytes T effecteurs.

Ajoutez des molécules de cytokines d’interleukine-2, ou IL-2, à la culture et incuberez. La liaison de l’IL-2 déclenche la signalisation intracellulaire, permettant la prolifération et la survie des lymphocytes.

Prenez un petit volume de la culture et centrifugez. Jetez le surnageant. Remettez en suspension la pastille cellulaire avec des cellules dendritiques présentatrices d’antigène et transférez-la dans le même puits.

La restimulation avec l’antigène augmente la prolifération des lymphocytes.

Effectuer une analyse en aval pour quantifier des marqueurs spécifiques associés à la prolifération lymphocytaire.

Pour générer des MoDC pulsés par antigène, ajoutez 1 microlitre par millilitre de vaccin contre le virus de la rage ou de suspension de VD à 1 millilitre de culture MoDC naïve dans la plaque à 24 puits, et incubez la plaque pendant 48 heures à 5 % de dioxyde de carbone et 37 degrés Celsius. Le septième jour, conservez la plaque de 24 puits contenant les MoDC pulsés par antigène sur de la glace pendant 10 minutes avant d’ajouter 1 millilitre de PBS glacé par puits et de bien mélanger. Transférez la suspension dans un tube de 15 millilitres.

Lavez les puits avec 2 millilitres de PBS glacé. Récupérez les cellules résiduelles dans chaque puits et transférez le contenu lavé dans leurs tubes respectifs. Centrifuger la suspension cellulaire à 500 g pendant 7 minutes. Après avoir jeté le surnageant, remettre en suspension la pastille de cellules MoDCs pulsée par antigène dans un milieu de culture complet pour ajuster la concentration finale de 100 000 cellules par millilitre.

Pour la co-culture de lymphocytes MoDC, ensemencez les puits d’une plaque stérile à 24 puits avec 1 millilitre de suspension de cellules lymphocytaires naïves et 1 millilitre de suspension de MoDC pulsée par antigène ou non pulsée par antigène le septième jour de l’impulsion d’antigène. Après deux jours d’incubation, complétez chaque puits avec 20 nanogrammes par millilitre d’interleukine-2 recombinante et poursuivez l’incubation pendant 120 heures supplémentaires.

Le 14e jour, transférez 1 millilitre de co-culture dans un tube stérile de 1,5 millilitre et centrifugez le tube. Ensuite, remettez en suspension la pastille cellulaire avec 1 millilitre de MoDC pulsés ou non pulsés par antigène. Mélangez bien et transférez les suspensions cellulaires dans les puits correspondants.

Après la coloration de la surface cellulaire des PBMC et des lymphocytes et monocytes naïfs, transférez 1 millilitre de suspension cellulaire dans un tube stérile de 1,5 millilitre à l’aide d’une pipette, puis centrifugez pendant 10 minutes à 500 g. Ensuite, remettez la pastille en suspension dans 1 millilitre de PBS et transférez-la dans un tube de 15 millilitres. Collectez également les cellules résiduelles et les tubes correspondants à l’aide de 1 millilitre de PBS. Ensuite, ajoutez 10 millilitres de PBS dans le tube de 15 millilitres contenant les cellules et mélangez par pipetage.

Après avoir centrifugé le tube pendant 7 minutes à 850 g, retirez le surnageant et remettez soigneusement en suspension la pastille cellulaire avec la suspension résiduelle laissée après décantation du surnageant. Transférez la suspension de la cellule sur une plaque à 96 puits à fond en V et scellez les puits pour éviter les déversements.

Une fois la coloration terminée, effectuez l’analyse par cytomètre en flux. À partir de l’aperçu en temps réel, ajustez le seuil de fluorescence, y compris la tension, le gain et la taille de la cellule pour éventuellement dessiner des portes autour de la population cellulaire souhaitée tout en excluant tout débris cellulaire.