Imagerie par résonance plasmonique de surface localisée pour détecter les sécrétions de protéines à partir d’une seule cellule

Commencez avec une puce de capteur en verre dotée de réseaux nanostructurés en or fonctionnalisés avec une monocouche auto-assemblée contenant des groupes carboxyles.

Fixez la puce dans un assemblage microfluidique et introduisez un linker, pour activer les groupes carboxyles.

Ajouter des ligands peptidiques, en conjuguant avec les groupes carboxyles activés via des liants.

Traitez avec un tampon contenant un composé désactivateur, désactivant les sites de liaison non spécifiques, et lavez avec un tampon.

Focalisez une lumière polarisée sur la puce. À l’aide d’un système d’imagerie par résonance plasmonique de surface localisé, obtenez une image des réseaux, apparaissant sous forme de carrés brillants sur un fond sombre.

À l’angle de résonance, les électrons d’or absorbent la lumière. Mesurez l’intensité de la lumière réfléchie à l’angle correspondant, pour générer la réponse du capteur.

Introduisez des cellules hybridomes sécrétant des protéines, qui se lient à la puce et au lavage.

Les cellules attachées sécrètent des protéines qui interagissent avec les ligands du réseau voisin.

Ces interactions modifient l’angle et l’intensité de la lumière réfléchie, ce qui entraîne une modification de la réponse du capteur, confirmant l’activité sécrétoire des cellules.

Pour nettoyer et régénérer la résonance plasmonique de surface localisée, ou puces LSPR, des cendres plasma à une puissance de 40 watts dans un mélange de 300 millilitres de 5 % d’hydrogène et de 95 % d’argon pendant 45 secondes. Fonctionnaliser la surface de l’or et les nanostructures immédiatement après l’incinération au plasma en immergeant la puce dans une solution de thiol éthanolique à deux composants composée d’un rapport de 3 pour 1 de SPO et de SPC. Après avoir laissé la puce dans la solution de thiol pendant la nuit pour former une monocouche auto-assemblée, rincez-la à l’éthanol et séchez-la avec de l’azote gazeux.

Chargez la puce LSPR dans un support microfluidique sur mesure en plaçant la puce sur une pièce inférieure en aluminium. Ensuite, prenez la puce en sandwich entre cette pièce inférieure et un joint en silicone, et une pièce supérieure en plastique transparent à l’aide de quatre vis pour serrer l’ensemble.

Pour une application typique de thiol à base de SPC, appliquez une couche de 300 microlitres d’un mélange 1 à 1 de 133 millimolaires d’EDC et de 33 millimolaires de NHS dans de l’eau distillée désionisée pour activer les groupes carboxyles du composant thiol SPC. Après avoir attendu 10 minutes, rincez manuellement la surface avec 10 millimolaires de PBS.

Ensuite, conjuguez le groupe carboxyle activé avec le ligand d’intérêt en enrobant 300 microlitres de la solution de ligand. Après avoir attendu 1 heure et rincé la surface avec 10 millimolaires de PBS, appliquez 300 microlitres d’éthanolamine à 0,1 molaire dans du PBS sur la puce pour minimiser la liaison non spécifique. Après avoir attendu 10 minutes, lavez l’éthanolamine avec du PBS, contenant 0,005 % de Tween 20 ou de PBS-T20.

Ensuite, placez un morceau de quartz au-dessus de la puce pour réduire les fluctuations des données liées à un ménisque changeant. Gardez la puce humide avec la mémoire tampon PBS-T20 lors du montage sur le microscope. Fixez le tube microfluidique à l’ensemble et au tampon d’écoulement jusqu’à ce qu’un état stable soit atteint. Ensuite, placez fermement l’ensemble d’embouts LSPR dans le porte-échantillon de platine chauffé.

La configuration optique de cette méthode est illustrée ici. La lumière de la lampe halogène passe à travers un filtre passe-partout de 593 nanomètres de long pour éliminer les longueurs d’onde, qui ne contribuent pas à la réponse nanoplasmonique. La lumière est ensuite polarisée linéairement et l’échantillon est éclairé via un objectif à ouverture numérique 40x 1,4 pour l’excitation des nanostructures d’or plasmoniques. La lumière diffusée est collectée par l’objectif et passée à travers un polariseur croisé pour réduire le signal de fond du substrat de verre. Un séparateur de faisceau 50/50 est inséré dans le trajet lumineux collecté pour une analyse spectroscopique et d’imagerie simultanée.

Après avoir laissé l’ensemble et le microscope s’équilibrer pendant au moins deux heures, alignez la puce à l’aide du joystick de sorte que le réseau central soit aligné avec la fibre optique pour la spectroscopie. Après avoir cultivé et granulé les cellules d’hybridome par centrifugation, récoltez-les. Ensuite, testez la viabilité avant de les introduire sur les puces LSPR. Ensuite, introduisez manuellement 50 microlitres de la solution cellulaire dans les puces LSPR à l’aide d’une micropipette. Enfin, lavez les cellules restantes en solution avec un milieu frais sans sérum à l’aide d’un système de perfusion microfluidique pour préparer les puces LSPR pour l’imagerie.