Quantification de l’activité de séquestration autophagique en vrac dans des cellules de mammifères

L’autophagie en vrac consiste à séquestrer la cargaison autophagique et les protéines cytosoliques solubles, y compris la lactate déshydrogénase ou LDH, dans les autophagosomes pour la dégradation.

Pour évaluer la séquestration de la LDH, reflétant l’activité autophagique en vrac, prendre une cuvette d’électroporation avec des cellules privées de nutriments traitées avec des inhibiteurs pour bloquer la dégradation autophagique-lysosomale.

Effectuer une électroporation pour perturber sélectivement la membrane cellulaire et libérer des protéines solubles.

Mélangez le perturbateur cellulaire avec une solution de saccharose tamponnée pour préserver les composants cellulaires.

Transférez la solution de perturbateur dilué requise dans un tube contenant un tampon. Centrifugeuse pour séparer la LDH non séquestrée de la LDH séquestrée dans les autophagosomes.

Transférez la solution restante de perturbateur dilué, contenant la fraction cellulaire totale de LDH, dans un autre tube.

Ajoutez un tampon contenant un tensioactif non ionique dans les deux tubes pour extraire les fractions LDH séquestrées et totales.

Centrifuger et transférer des surnageants contenant de la LDH dans des tubes contenant des tampons contenant du pyruvate et du NADH.

La LDH convertit le pyruvate en lactate avec l’oxydation du NADH, diminuant les niveaux de NADH en corrélation avec la concentration de LDH.

Quantifier la LDH dans les fractions cellulaires sédimentées et totales pour déterminer la séquestration de la LDH.

À l’aide d’une pipette, remettre en suspension la pastille cellulaire pour obtenir une suspension presque unicellulaire. Transférez cette suspension sur une cuvette d’électroporation de 4 millimètres. Placez la cuvette dans un électroporateur à ondes de désintégration exponentielle et déchargez une seule impulsion électrique à 800 volts, 25 microfarads et 400 ohms.

À l’aide d’une nouvelle pointe de pipette, transférez la cellule dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millimètre contenant 400 microlitres de solution glacée de saccharose tamponnée au phosphate, et mélangez brièvement par pipetage. Répétez ce processus de remise en suspension, de rupture d’électrode et de mélange pour chaque échantillon. Si vous effectuez la procédure pour la première fois, assurez-vous de vérifier l’efficacité et la sélection de la rupture de l’électrode de la membrane plasmique comme décrit dans le texte.

Pour obtenir des fractions de LDH sédimentées, prélevez 550 microlitres de chaque solution diluée de cellules perturbées et transférez-les dans son propre tube de microcentrifugation de 2 millilitres contenant 900 microlitres de tampon de remise en suspension glacé avec 0,5 % de BSA et 0,01 % de Tween-20. Pipeter brièvement pour mélanger. Centrifuger à 18 000 fois g et 4 degrés Celsius pendant 45 minutes pour produire des granulés contenant de la LDH sédimentée. À l’aide de l’aspiration, aspirez soigneusement le surnageant pour laisser les granulés aussi secs que possible.

Conservez les échantillons de LDH sédimentés à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être analysés. Pour les fractions totales de LDH, transférez 150 microlitres de chacune des solutions diluées de cellules perturbées dans son propre nouveau tube. Conservez-les dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius jusqu’au moment de les analyser.

Décongeler les échantillons de LDH sédimentés et les échantillons de LDH totale sur de la glace. Une fois décongelé, ajoutez 300 microlitres de tampon de remise en suspension glacé contenant 1,5 % de Triton X-405 au total des échantillons de LDH. Faites tourner les échantillons sur un rouleau dans une chambre froide pendant 30 minutes. Ensuite, ajoutez 750 microlitres de tampon de remise en suspension glacé contenant 1 % de Triton X-405 aux échantillons de LDH sédimentés. À l’aide d’une pipette, les granulés sont remis en suspension jusqu’à ce que la solution soit homogène. Centrifugez tous les échantillons à 18 000 fois g à 4 degrés Celsius pendant cinq minutes pour sédimenter les débris cellulaires non dissous.

Une fois la centrifugation terminée, placez les échantillons sur de la glace. Déterminer les niveaux de LDH dans les surnageants à l’aide d’un test enzymatique classique tel que décrit dans le texte ou de l’un des nombreux kits disponibles dans le commerce.