Quantification de l’activité de séquestration autophagique en vrac dans des cellules de mammifères

L’autophagie en vrac consiste à séquestrer la cargaison autophagique et les protéines cytosoliques solubles, y compris la lactate déshydrogénase ou LDH, dans les autophagosomes pour la dégradation.

Pour évaluer la séquestration de la LDH, reflétant l’activité autophagique en vrac, prendre une cuvette d’électroporation avec des cellules privées de nutriments traitées avec des inhibiteurs pour bloquer la dégradation autophagique-lysosomale.

Effectuer une électroporation pour perturber sélectivement la membrane cellulaire et libérer des protéines solubles.

Mélangez le perturbateur cellulaire avec une solution de saccharose tamponnée pour préserver les composants cellulaires.

Transférez la solution de perturbateur dilué requise dans un tube contenant un tampon. Centrifugeuse pour séparer la LDH non séquestrée de la LDH séquestrée dans les autophagosomes.

Transférez la solution restante de perturbateur dilué, contenant la fraction cellulaire totale de LDH, dans un autre tube.

Ajoutez un tampon contenant un tensioactif non ionique dans les deux tubes pour extraire les fractions LDH séquestrées et totales.

Centrifuger et transférer des surnageants contenant de la LDH dans des tubes conten