Un test pour évaluer l’efficacité d’un médicament contre un modèle d’infection à Mycobacterium tuberculosis

Prenez une plaque multipuits contenant un modèle d’infection à Mycobacterium tuberculosis ou Mtb établi.

Les puits contiennent des agrégats cellulaires comprenant un noyau de macrophages nécrotiques infectés par Mtb et Mtb densément tassés, entourés de macrophages non infectés – imitant l’infection in vivo.

Prenez une dilution en série des antibiotiques rifampicine et moxifloxacine.

Jetez le milieu de la plaque d’infection, transférez les dilutions d’antibiotiques dans les puits et incuberez.

Les antibiotiques se diffusent à travers les agrégats cellulaires et pénètrent dans les cellules bactériennes.

La rifampicine se lie à l’ARN polymérase bactérienne, inhibant la synthèse de l’ARN et provoquant la mort bactérienne.

La moxifloxacine se lie à la topoisomérase de l’ADN bactérien, inhibant la réplication et arrêtant la croissance bactérienne. La liaison induit également des réponses de stress, y compris l’accumulation d’espèces réactives de l’oxygène, tuant les bactéries.

Après l’incubation, ajoutez de la resazurine - un indicateur redox. À l’intérieur des bactéries vivantes et métaboliquement actives, l’enzyme oxydoréductase réduit la résazurine bleue en résorufine fluorescente rose.

Mesurez la fluorescence pour détecter les bactéries viables.

La survie bactérienne diminue avec l’augmentation de la concentration d’antibiotiques, ce qui démontre leur efficacité contre le Mtb.

Pour le dépistage des drogues, préparez deux médicaments antituberculeux en trois exemplaires sur une nouvelle plaque à 96 puits comme suit. Tout d’abord, ajoutez 125 microlitres de milieu 7H9-C aux puits B2 à G10. Ensuite, préparez les deux médicaments au double de la concentration finale souhaitée la plus élevée dans 1 millilitre de 7H9-C.

À l’aide d’une pipette, ajoutez 250 microlitres de chaque médicament dans les puits B, C et D-11, puis E, F et G-11 respectivement pour les traitements en trois exemplaires. Ensuite, à l’aide d’une pipette multicanaux, diluez en série les médicaments testés deux fois en déplaçant 125 microlitres de B11 à G11 dans B10 à G10. Mélanger par pipetage cinq fois à chaque étape.

Continuez à déplacer 125 microlitres d’une colonne à l’autre, de droite à gauche sur la plaque, et arrêtez-vous après la colonne 4. Après avoir mélangé la colonne 4, jetez 125 microlitres dans un conteneur à déchets. Les colonnes 2 et 3 ne doivent pas contenir de médicaments. Cela leur permettra d’être utilisés comme arrière-plan et pour des contrôles de croissance positifs.

Ensuite, récupérez la plaque de 96 puits contenant les macrophages infectés par Mtb dans l’incubateur. Sans incliner la plaque, à l’aide d’une pipette multicanaux, prélever 150 microlitres de fluide dans les puits B2 à G11. Ensuite, inclinez la plaque comme indiqué ici, et insérez les pointes de la pipette dans le bord inférieur des puits, et retirez le milieu restant, environ 50 microlitres.

Comme les agrégats de macrophages Mtb adhèrent au fond du puits, aucun matériau ne doit être perdu. Cependant, l’élimination du fluide doit être aussi douce que possible et des précautions doivent être prises pour éviter la remise en suspension au cours de ce processus.

Doucement, ajoutez 100 microlitres de milieu 7H9-C aux puits B2 à G11 de la plaque, qui contiennent les agrégats de macrophages Mtb. À l’aide d’une pipette multicanaux, transférez 100 microlitres de la plaque à 96 puits contenant le médicament dans les puits correspondants de la plaque d’infection. Ensuite, placez l’assiette dans un sac scellé et incubez-la pendant trois jours à 37 degrés Celsius.

Le dosage de la résazurine s’appuie sur les espèces oxydatives produites par le Mtb métaboliquement actif pour convertir la résazurine bleue en résorufine rose fluorescente. Le changement de couleur et de fluorescence peut être utilisé comme marqueur de substitution pour déterminer la quantité de croissance bactérienne.

Préparez une solution mère de résazurine à une concentration finale de 0,8 milligramme par millilitre dans l’eau. Filtrer à travers une membrane PVDF de 0,22 micromètre pour la stérilisation. Préparez une solution de travail dans du réactif en mélangeant la solution mère, l’eau et le Tween-80 dans un rapport de 2 à 1 à 1. Les concentrations finales sont de 0,4 milligramme par millilitre de résazurine dans 5 % de Tween-80.

À l’aide d’un lecteur de plaques, configurez un programme pour lire la fluorescence à une excitation de 530 nanomètres et une émission de 590 nanomètres pendant 24 heures toutes les 30 minutes à 37 degrés Celsius. Préchauffez le lecteur de plaques à 37 degrés Celsius.

À l’aide d’une pipette multicanaux, ajoutez 20 microlitres de solution de travail de résazurine dans les puits B2 à G11 de la plaque traitée par le médicament. Placez la plaque sur le lecteur et démarrez le programme.