Encyclopédie des expériences JoVE
Immunologie
0 vues • 3:53 min • July 8th, 2025
Prenez une plaque multipuits avec différents macrophages rapporteurs hébergeant le gène de la phosphatase alcaline embryonnaire sécrétée, ou SEAP, ou un gène de la luciférase sécrété sous promoteurs inductibles.
Ajouter des milieux contenant différents hybrides de nanoparticules peptide-or mélangés à des lipopolysaccharides ou à des LPS dans des puits désignés.
Le LPS se lie aux récepteurs de type Toll des macrophages, ou TLR, déclenchant l’internalisation dans l’endosome.
La pompe à protons endosomale transporte les protons à l’intérieur. L’acidification déclenche la signalisation TLR, activant les facteurs de transcription.
Ces facteurs induisent l’expression des gènes rapporteurs, produisant SEAP ou luciférase.
Alternativement, l’internalisation du LPS avec les hybrides amène les groupes peptidiques chargés négativement à séquestrer les protons luminaux, empêchant l’acidification endosomale et inhibant la signalisation TLR.
Recueillir le milieu, centrifuger pour séparer le surnageant et ajouter des substrats pour le PAED et la luciférase.
Le PAED convertit son substrat en un produit coloré, tandis que la luciférase catalyse son substrat pour produire de la luminescence.
Une réduction des signaux rapporteurs indique l’efficacité des hybrides dans l’inhibition de la signalisation TLR.
Centrifuger 20 volumes de la solution hybride peptide-GNP dans des tubes eppendorf de 1,5 millilitre à 18 000 fois g pendant 30 minutes. Jetez soigneusement les surnageants. Transférez les hybrides dans un seul tube frais et lavez-les deux fois avec 1 millilitre de PBS. Après cela, remettez en suspension les hybrides lavés dans un volume de milieu R10. Mélangez des volumes égaux d’hybrides concentrés et du milieu R10 contenant du LPS de sorte que la concentration finale des hybrides et du LPS soit respectivement de 100 nanomolaires et de 10 nanogrammes par millilitre.
Ensuite, retirez le milieu de culture de la plaque de culture de macrophages. Ajoutez 100 microlitres du mélange hybride-LPS dans chaque puits avec trois répétitions pour chaque condition. Inclure un contrôle négatif et un contrôle LPS. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 24 heures, puis transférer le milieu de chaque puits dans un tube de centrifugation séparé. Centrifugez les tubes à 18 000 fois g à 4 degrés Celsius pendant 30 minutes. Transférez les surnageants dans une plaque à fond rond fraîche à 96 puits.
Pour commencer l’analyse du rapporteur sur ces échantillons, ajoutez 180 microlitres de solution QUANTI-Blue préchauffée à chaque puits d’une nouvelle plaque à fond plat de 96 puits, puis transférez 20 microlitres de surnageants de chaque échantillon dans cette plaque. Incuber à 37 degrés Celsius pendant une à deux heures jusqu’à ce que la couleur bleu foncé atteigne une densité optique supérieure à 1. Après cela, utilisez un lecteur de plaques pour enregistrer l’absorption à 655 nanomètres. Ensuite, transférez 10 microlitres de surnageant frais de chaque échantillon dans une plaque blanche transparente à fond plat de 96 puits.
À l’aide d’un injecteur automatique, ajoutez 50 microlitres de la solution de luciférase dans chaque puits et enregistrez immédiatement la luminescence puits par puits. Ensuite, validez l’effet inhibiteur des candidats potentiels et évaluez la spécificité du TLR comme indiqué dans le protocole texte.