Dosage de la formation de focalisation pour quantifier les titres de virus dans les organes d’une souris infectée

Prenez une plaque multipuits contenant une monocouche de cellules de mammifères.

Inoculer les puits avec des dilutions en série d’homogénats de tissus contenant le virus Zika, dérivé de différents organes d’une souris infectée.

Lors de l’entrée dans les cellules via l’endocytose, le virus se multiplie et bourgeonne pour infecter les cellules voisines.

Recouvrir d’une solution de méthylcellulose à haute viscosité, créant une barrière physique qui limite le mouvement du virus.

La barrière ne permet d’infecter que les cellules voisines immédiates, formant des foyers de cellules infectées, et garantit que chaque foyer provient d’une seule particule virale, ce qui permet une quantification précise.

Fixer les cellules et perméabiliser la membrane. Ajoutez des anticorps primaires qui pénètrent dans les cellules et interagissent avec l’antigène viral.

Introduisez un anticorps secondaire conjugué à la peroxydase qui se lie à l’anticorps primaire.

Ajoutez un substrat chromogène qui est converti par la peroxydase pour créer des taches colorées, indiquant les foyers des cellules infectées.

Comptez les foyers pour quantifier le titre de virus dans les différents organes de la souris.

Retirez les échantillons homogénéisés du congélateur à moins 80 degrés Celsius et laissez-les décongeler. Avec les échantillons sur de la glace, diluez le virus Zika 10 fois dans le premier puits de la plaque de dilution et utilisez une pipette multicanaux pour effectuer des dilutions en série de 10 fois le long de la plaque, en changeant d’embouts à chaque fois en ajoutant 20 microlitres d’échantillon dans 180 microlitres de milieu de croissance.

Changez les pointes de pipette entre chaque dilution. Préparez la plaque de formation de focalisation en retirant le support de la plaque à fond plat à 96 puits préparée recouvrant les cellules Vero. Pour éviter que la monocouche ne se dessèche, ajoutez immédiatement 100 microlitres de dilution du virus dans chaque puits de la plaque Vero. Utilisez le même ensemble d’embouts pour ajouter de la concentration la plus faible à la plus élevée.

Rochez les plaques d’un côté à l’autre 2 à 4 fois et incubez à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant une à deux heures. Réchauffer 2 % de méthylcellulose à température ambiante. Ensuite, diluez la solution de méthylcellulose à 2 % dans un milieu de croissance dans un rapport d’environ 2 à 1. Après l’incubation, ajoutez 125 microlitres de milieu de croissance de méthylcellulose dans chaque puits des plaques de 96 puits. Incuber à nouveau à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 32 à 40 heures.

Pour fixer les cellules Vero, dans une armoire de biosécurité, ajoutez 50 microlitres de paraformaldéhyde à 5 % sur la couche de méthylcellulose dans chaque puits des plaques de 96 puits. Incuber pendant 60 minutes à température ambiante. Vous pouvez également couvrir les assiettes d’un parafilm et les placer à 4 degrés Celsius pendant la nuit.

Ensuite, utilisez une pipette pour retirer le recouvrement et le milieu des cellules dans un récipient jetable à l’intérieur de l’enceinte de biosécurité. Laver délicatement avec 150 microlitres de PBS par puits. Retirez le PBS des plaques et retirez la plaque de l’enceinte de sécurité biologique. Répétez le lavage PBS deux fois. Ensuite, ajoutez 150 microlitres par puits une fois tampon de lavage FFA et laissez à température ambiante pendant 5 à 10 minutes pour perméabiliser les cellules fixes.

Ensuite, utilisez un anticorps primaire contre le virus Zika pour détecter l’infection. Préparez l’anticorps primaire 4G2 à une concentration de 1 microgramme par millilitre dans un tampon de coloration FFA. Retirez le tampon de lavage FFA des plaques et ajoutez 50 microlitres de l’anticorps primaire dans le tampon de coloration FFA dans chaque puits. Ensuite, scellez les plaques avec du parafilm ou un film plastique et incubez toute la nuit à 4 degrés Celsius.

Préparez l’anticorps secondaire de chèvre anti-souris marqué HRP à une concentration de 1 à 5 000 dans un tampon de coloration FFA. Après avoir retiré la solution d’anticorps, lavez les cellules trois fois avec 150 microlitres de tampon de lavage FFA par puits. Retirez le tampon de lavage en le jetant dans l’évier à chaque fois.

Colorez les cellules avec l’anticorps secondaire dans un tampon de coloration FFA à 50 microlitres par puits et incubez une à deux heures à température ambiante. Après cela, lavez à nouveau les cellules trois fois avec le tampon de lavage FFA, en retirant le tampon de lavage en le jetant dans l’évier à chaque fois.

Ajoutez 50 microlitres de substrat Trueblue dans chaque puits. Attendez 2 à 15 minutes jusqu’à ce que les taches soient complètement définies avec un arrière-plan minimal. Une fois que les taches sont visibles, lavez doucement à l’eau à l’aide d’une main pour protéger la monocouche de la force de l’eau qui coule. Sécher sur du papier absorbant.

Peu de temps après, utilisez une lunette de dissection pour compter manuellement les taches dans chaque puits ou utilisez un compteur de taches automatisé. Dans le logiciel d’immunocapture, sélectionnez une dilution avec des foyers facilement distingués entre 20 et 200 par puits pour chaque échantillon, et calculez le titre en unités formant un foyer par millilitre en utilisant la moyenne des puits dupliqués.