Les effets du stress de cisaillement sur les plaquettes traitées avec des anticorps contre les récepteurs mécanosensoriels

Commencez avec une plaque multi-puits contenant du plasma riche en plaquettes. Les plaquettes expriment des complexes mécanorécepteurs de surface, qui répondent aux stimuli mécaniques.

Le complexe mécanorécepteur contient le domaine de liaison au ligand extracellulaire et la région macro-glycopeptide liée au domaine mécanosensoriel.

Introduire des anticorps anti-mécanorécepteurs, en se réticulant avec les domaines de liaison aux ligands des récepteurs sur les plaquettes opposées.

Placez une gouttelette de suspension de plasma traitée par anticorps entre les assemblages du viscosimètre.

Appliquer une contrainte de cisaillement, simulant la force mécanique, en éloignant les récepteurs liés aux anticorps des plaquettes, conduisant à la dissociation de la région macro-glycopeptide du domaine mécanosensoriel.

Cela déclenche un changement conformationnel dans le domaine mécanosensoriel, activant les plaquettes et entraînant l’expression de marqueurs de surface.

Transférez la suspension plaquettaire cisaillée dans un nouveau puits à l’intérieur de la plaque multipuits.

Introduisez un cocktail de molécules spécifiques aux marqueurs marqués au fluorophore qui interagissent avec les marqueurs de surface plaquettaires correspondants et fixez les cellules avec une solution fixatrice.

En cytométrie en flux, des signaux de fluorescence distincts sont en corrélation avec les effets du stress de cisaillement sur les plaquettes traitées par anticorps.

Pour le traitement des ligands, ajoutez lentement l’anticorps ou le ligand d’intérêt au plasma riche en plaquettes et mélangez doucement les plaquettes. Pendant l’incubation, allumez le viscosimètre à plaque conique et réglez la température de la plaque à 22 degrés Celsius. Après 5 à 10 minutes, transférez le plasma riche en plaquettes traité sur le viscosimètre à plaque conique à température contrôlée directement au centre de la plaque, en prenant soin que tout l’échantillon soit déposé entre le cône et la plaque au point de contact.

Pour appliquer un cisaillement à l’échantillon, calculez le cisaillement conformément au manuel du viscosimètre et appliquez un cisaillement à l’échantillon à la vitesse et à la durée appropriées. À la fin de l’application, soulevez le cône d’environ 2 millimètres de la plaque, de sorte que l’échantillon reste en contact avec la plaque et le cône, et utilisez une pointe de pipette à chargement de gel pour prélever 5 à 10 microlitres du centre du volume de l’échantillon. Ensuite, incubez l’échantillon cisaillé avec des anticorps contre les marqueurs de surface d’intérêt pendant 20 minutes à température ambiante, et fixez les échantillons dans du paraformaldéhyde à 2 % pendant 20 minutes à température ambiante.

Pour analyser les échantillons par cytométrie en flux, collectez au moins 20 000 événements pour chaque condition et quantifiez l’intensité du signal de chaque marqueur fluorescent à l’aide de la valeur de hauteur pour l’intensité de chaque fluorophore. Ensuite, utilisez un témoin négatif avec de l’albumine sérique bovine ou un véhicule pour tracer une porte excluant les événements fluorescents de fond négatifs, et quantifiez le pourcentage d’événements à l’intérieur de la porte pour toutes les conditions expérimentales.