Un test in vitro pour quantifier la croissance intracellulaire du parasite dans les macrophages

Prenez deux microplaques contenant des lamelles avec des macrophages dérivés de la moelle osseuse ou BMM.

Ajoutez des promastigotes métacycliques de Leishmania – le stade flagellé allongé – dans une plaque et des amastigotes – le stade ovale non flagellé – dans une autre plaque.

Pendant l’incubation, les parasites se lient aux récepteurs des macrophages, déclenchant une phagocytose médiée par les récepteurs.

Le phagosome fusionne avec les lysosomes et les vésicules dérivés du réticulum endoplasmique et de l’appareil de Golgi, se transformant en une vacuole parasitophore.

La diminution du pH de la vacuole déclenche la différenciation du promastigote en amastigote et sa réplication.

Laver pour éliminer les parasites non internalisés.

Fixez les macrophages infectés et ajoutez un détergent pour perméabiliser les cellules et les parasites.

Introduisez un colorant d’acide nucléique fluorescent pour colorer les noyaux des macrophages et des parasites.

Montez les lamelles sur des lames et observez au microscope à fluorescence, en quantifiant les plus grands noyaux de l’hôte et les petits noyaux d’amastigote environnants.

Comparez le nombre d’amastigotes pour évaluer leur multiplication dans les macrophages initialement infectés par des promastigotes indifférenciés par rapport à ceux infectés par des amastigotes réplicatifs.

Pour infecter les cellules avec L. Amazonensis, diluez la suspension parasitaire à la multiplicité expérimentale appropriée de l’infection, et ajoutez 50 à 100 microlitres de parasites dans chaque puits de toutes les plaques à 6 puits, y compris tous les points temporels de l’expérience. Incuber les macrophages dérivés de la moelle osseuse pendant la période d’infection et la température appropriées. Ensuite, lavez les puits trois fois avec 2 millilitres de PBS frais à 37 degrés Celsius sans calcium ni magnésium par puits, et fixez les échantillons initiaux avec 1,5 à 2 millilitres de paraformaldéhyde à 2 % pendant 10 minutes.

Pour les plaques correspondant aux points temporels ultérieurs, ajoutez 2 millilitres de milieu de macrophage frais dérivé de la moelle osseuse dans chaque puits et remettez les plaques dans l’incubateur approprié. Ensuite, fixez et lavez les cellules pour chaque point temporel restant, comme nous venons de le démontrer, et stockez les échantillons à 4 degrés Celsius dans du PBS frais.

Pour colorer les cellules avec du DAPI, remplacez le surnageant par 1,5 millilitres de PBS frais sans calcium ni magnésium, complété par un détergent non ionique à 0,1 % pendant 10 minutes à température ambiante, suivi de trois lavages de 2 millilitres avec du PBS sans calcium ni magnésium. Ensuite, colorez les cellules avec 2 microgrammes par millilitre de DAPI dans 1 millilitre de PBS pendant 1 heure à température ambiante.

Après trois lavages, placez les lamelles côté cellule vers le bas sur des lames de microscope en verre individuelles montées avec un réactif de montage anti-décoloration disponible dans le commerce. Ensuite, pour quantifier le nombre de cellules infectées, utilisez l’objectif à huile d’immersion 100x d’un microscope à fluorescence et d’un compteur Emanuel, pour identifier le nombre de petits noyaux d’amastigote regroupés autour de chaque grand noyau de macrophage coloré au DAPI.