Un test de libération de colorant pour quantifier l’activité enzymatique de protéines antimicrobiennes

Commencez avec un tube contenant une suspension bactérienne tuée par la chaleur et traitez avec une solution de colorant.

Les molécules de colorant se lient de manière covalente au peptidoglycane, un composant essentiel de la paroi cellulaire bactérienne, conférant une coloration bleue.

Granulez les bactéries et retirez le surnageant contenant des molécules de colorant non liées.

Remettez les bactéries en suspension et introduisez une solution protéique antimicrobienne dans le tube, déclenchant l’hydrolyse enzymatique du peptidoglycane bactérien, entraînant une dégradation de la paroi cellulaire suivie d’une lyse cellulaire.

Cela conduit à la libération des molécules de colorant, conférant une coloration bleue.

Ajoutez de l’éthanol - un agent dénaturant des protéines, inactivant les protéines antimicrobiennes et mettant fin à la réaction enzymatique.

Centrifugez le contenu pour granuler les fragments cellulaires et les enzymes. Transférez le surnageant contenant la molécule de colorant dans une plaque à plusieurs puits.

À l’aide d’un lecteur de plaques, mesurez l’absorbance à 595 nanomètres.

Comparer l’absorbance de l’échantillon traité aux enzymes avec celle de l’échantillon non t