Un test de libération de colorant pour quantifier l’activité enzymatique de protéines antimicrobiennes

Commencez avec un tube contenant une suspension bactérienne tuée par la chaleur et traitez avec une solution de colorant.

Les molécules de colorant se lient de manière covalente au peptidoglycane, un composant essentiel de la paroi cellulaire bactérienne, conférant une coloration bleue.

Granulez les bactéries et retirez le surnageant contenant des molécules de colorant non liées.

Remettez les bactéries en suspension et introduisez une solution protéique antimicrobienne dans le tube, déclenchant l’hydrolyse enzymatique du peptidoglycane bactérien, entraînant une dégradation de la paroi cellulaire suivie d’une lyse cellulaire.

Cela conduit à la libération des molécules de colorant, conférant une coloration bleue.

Ajoutez de l’éthanol - un agent dénaturant des protéines, inactivant les protéines antimicrobiennes et mettant fin à la réaction enzymatique.

Centrifugez le contenu pour granuler les fragments cellulaires et les enzymes. Transférez le surnageant contenant la molécule de colorant dans une plaque à plusieurs puits.

À l’aide d’un lecteur de plaques, mesurez l’absorbance à 595 nanomètres.

Comparer l’absorbance de l’échantillon traité aux enzymes avec celle de l’échantillon non traité aux enzymes pour quantifier l’activité enzymatique de la protéine antimicrobienne.

Dans le test de libération de colorant, le substrat est lié de manière covalente au colorant Remazol Brilliant Blue R ou RBB. Commencez ce protocole en créant une solution RBB de 200 millimolaires. Dissoudre 1,25 gramme de RBB dans une solution d’hydroxyde de sodium fraîchement préparée.

Ensuite, remettez en suspension les cellules bactériennes tuées par la chaleur à une concentration de 0,5 gramme de poids humide dans 30 millilitres de solution RBB. Pour le peptidoglycane purifié, remettez le peptidoglycane en suspension à une concentration de 0,3 gramme de poids humide et 30 millilitres de solution RBB.

Étant donné que les étapes suivantes sont les mêmes quel que soit le substrat utilisé, le marquage ne sera démontré que pour les cellules bactériennes. Incuber le mélange réactionnel sur une plate-forme rotative pendant six heures à 37 degrés Celsius en mélangeant doucement. Après six heures, transférez le mélange réactionnel dans un incubateur à 4 degrés Celsius et incubez pendant 12 heures supplémentaires en mélangeant doucement.

Lorsque l’incubation est terminée, récoltez le substrat teint par centrifugation à 3 000 fois g pendant 30 minutes. Décantez la solution de colorant de la pastille de substrat. Remettez complètement le granulé en suspension dans de l’eau de type 1 suivi d’une centrifugation. Lavez les cellules marquées au colorant trois à cinq fois de cette manière pour éliminer le colorant soluble non lié de manière covalente des substrats.

Pour les lavages finaux, transférez la portion de granulés qui sera utilisée dans le test de libération de colorant dans des tubes de microfuge de 1,5 millilitre. Le surnageant du dernier lavage doit être clair, tandis que le substrat reste bleu. Stockez le substrat teint en suspension dans une quantité minimale d’eau à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi.

Pour préparer l’essai de libération de colorant, laissez le substrat teint congelé revenir à température ambiante et lavez-le deux fois avec le tampon d’essai qui a été déterminé empiriquement pour l’enzyme. PBS est utilisé, dans ce cas. Calculez le volume de suspension de substrat nécessaire en multipliant le volume de réaction de 200 microlitres par le nombre de tests de libération de colorant à effectuer.

Pour préparer la suspension du substrat, ajoutez d’abord le substrat teint au volume approprié de PBS. Effectuez une dilution un à un et effectuez une première mesure de la densité optique à 595 nanomètres en utilisant PBS comme blanc. Ajoutez des quantités incrémentielles du substrat teint à la suspension jusqu’à ce qu’une densité optique de 2,0 à 595 nanomètres soit atteinte.

Dans cette démonstration, le test de libération de colorant sera utilisé pour déterminer les conditions d’incubation optimales d’un antimicrobien protéique. Tout d’abord, préparez une suspension antimicrobienne de protéines mères en ajustant la concentration à 1 milligramme par millilitre à l’aide de PBS, comme décrit dans le texte du protocole. Ensuite, diluez la suspension antimicrobienne de protéine mère à une concentration de 100 nanogrammes par microlitre.

Cette concentration donne une masse réactionnelle finale de 1 microgramme de protéine par volume ajouté à la réaction de dosage. Effectuer les tests de réaction dans des tubes microfuges de 0,5 millilitre pour la plage thermique à évaluer. Pour chaque condition thermique, ajoutez 10 microlitres de protéine mère à 200 microlitres de suspension de substrat préparée.

Incuber dans un thermocycleur pendant huit heures avec mélange par inversion une fois par heure. Après l’incubation, arrêtez les réactions en ajoutant 25 microlitres d’éthanol dans chaque tube de microfuge. Pour éliminer le substrat insoluble non digéré, centrifuger à 3 000 fois g pendant deux minutes. Après cela, tout en faisant attention de ne pas perturber la pastille de substrat non digéré, transférez 150 microlitres du surnageant de réaction pour chaque mélange réactionnel dans une microplaque à fond plat de 96 puits.

Pour quantifier l’activité enzymatique, utilisez un spectrophotomètre de microplaques pour mesurer l’absorbance du surnageant à 595 nanomètres. L’augmentation de l’absorbance par le colorant soluble libéré dans le surnageant à partir du substrat marqué est une mesure quantitative de l’activité enzymatique.