JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 vues • 5:10 min • July 8th, 2025
Traitez à la fois la pyomélanine et les souches bactériennes non productrices de pyomélanine avec un agent de test.
La pyomélanine, un pigment extracellulaire, offre une protection contre le stress oxydatif.
L’agent de test perturbe la biosynthèse de la pyomélanine, réduisant ainsi sa production.
Après l’incubation, effectuer des dilutions bactériennes en série avec un tampon contenant l’agent d’essai ou le solvant du véhicule.
Repérez les dilutions bactériennes sur des plaques de gélose avec des concentrations variables de peroxyde d’hydrogène - un facteur de stress oxydatif.
Les plaques dépourvues de peroxyde d’hydrogène servent de témoins.
couver. Dans les plaques témoins, les bactéries forment des colonies.
Dans la souche productrice de pyomélanine non traitée, la pyomélanine protège les bactéries des dommages oxydatifs induits par le peroxyde d’hydrogène, ce qui entraîne des colonies pigmentées.
Cependant, la souche productrice de pyomélanine traitée avec l’agent d’essai, présentant une réduction de la pyomélanine, devient sensible au stress oxydatif, entraînant la mort bactérienne.
Comptez les colonies.
La réduction du nombre et de la taille des colonies avec l’augmentation des concentrations de peroxyde d’hydrogène dans les souches traitées productrices de pyomélanine et les souches traitées et non traitées ne produisant pas de pyomélanine par rapport aux témoins indique une sensibilité bactérienne accrue au stress oxydatif.
Pour commencer cette procédure, mettez en place des cultures nocturnes des souches à tester dans LB, avec et sans NTBC. Le lendemain, préparez des plaques de gélose LB contenant du peroxyde d’hydrogène comme facteur de stress oxydatif. Tout d’abord, faites fondre les flacons de gélose LB et refroidissez le support à environ 50 degrés Celsius à température ambiante.
Ensuite, ajoutez du peroxyde d’hydrogène directement dans le média refroidi aux concentrations souhaitées. Agitez la fiole pour mélanger. Une gamme de concentrations de peroxyde d’hydrogène de 0 à 1 millimolaire est un bon point de départ. Versez les assiettes immédiatement et flammez la surface pour éliminer les bulles. Le rendement est de quatre plaques pour 100 millimètres de gélose LB. Marquez les plaques avec la concentration en peroxyde d’hydrogène.
Placez les plaques découvertes dans une hotte à flux biologique, avec un ventilateur en marche pendant 30 minutes pour éliminer l’excès d’humidité des plaques. Les plaques doivent être utilisées le jour même de leur préparation. Pendant que les plaques sèchent, lavez et mesurez la DO 600 des cultures de nuit.
Normaliser la DO 600 de toutes les cultures de nuit à la valeur la plus basse pour l’ensemble des souches testées. Pour ce faire, déterminez le volume de culture nécessaire pour diluer la culture à la DO 600 la plus faible dans un volume total de 1 millilitre.
Par exemple, si une culture a une DO 600 de 3 et que la DO 600 la plus basse pour l’ensemble des souches est de 2,5, effectuez le calcul suivant, ce qui donnera 0,833 millilitres comme volume de culture nécessaire. Placez 0,833 millilitres de culture dans un tube de microfuge. Ensuite, calculez la quantité de LB plus NTBC ou de LB plus DMSO nécessaire pour porter le volume de culture à 1 millilitre. Dans cet exemple, la quantité serait de 0,167 millilitre. Mélanger par vortex.
Pour maintenir les cultures à une concentration constante de NTBC ou de DMSO, effectuez des dilutions en série de 10 fois des cultures de nuit normalisées dans PBS plus NTBC ou PBS plus DMSO. Préparez des solutions mères de PBS plus NTBC et PBS plus DMSO en augmentant ou en diminuant l’échelle, en fonction du nombre de souches testées.
Pour une série de dilutions pour une souche, mélanger 300 micromolaires de NTBC ou un volume équivalent de DMSO avec du PBS pour obtenir un volume total de 720 microlitres. Ajoutez 90 microlitres de PBS plus NTBC ou PBS plus DMSO aux tubes de microfuge appropriés étiquetés pour 10 à moins 1 à 10 à moins 7 dilutions en série. Ajoutez 10 microlitres de culture aux 10 appropriés dans le tube de dilution moins 1.
Mélanger par vortex, et transférer 10 microlitres de la dilution 10 à moins 1 dans le tube de dilution 10 à moins 2. En changeant les pointes de pipette entre les dilutions, répétez l’opération jusqu’à ce que toutes les dilutions aient été effectuées.
Repérez 5 microlitres de dilutions de 10 à moins 3 à 10 à moins 7 sur des plaques de peroxyde d’hydrogène LB plus en double pour chaque souche. Utilisez une pointe de pipette si les points sont plaqués pour que la dilution soit la plus faible. Ne renversez pas ou n’inclinez pas la plaque jusqu’à ce que le liquide ait séché dans la plaque. Incuber les plaques à 37 degrés Celsius. Pendant 24 à 48 heures, selon la souche. Une fois que les colonies de bonne taille sont apparues, photographiez les plaques à l’aide d’une caméra CCD au-dessus d’un transilluminateur.