Encyclopédie des expériences JoVE
Immunologie
0 vues • 6:41 min • July 8th, 2025
Prenez une plaque de microtitration avec un couvercle doté de supports cylindriques, ou chevilles, recouverts de biofilms bactériens.
Placez le couvercle à cheville recouvert d’un biofilm sur des puits de plaque de microtitration avec tampon pour éliminer les bactéries faiblement attachées ou planctoniques, en vous concentrant sur les mesures attachées au biofilm.
Transférez le couvercle à cheville recouvert d’un biofilm rincé sur une plaque de défi avec des concentrations croissantes d’agent antibactérien d’essai. Incuber sans secouer.
En fonction de la concentration et du potentiel antibactérien de l’agent, il perturbe l’activité métabolique bactérienne et l’intégrité du biofilm.
Après l’incubation, placez le couvercle de la cheville sur des puits de plaque contenant du tampon pour éliminer les bactéries planctoniques.
Transférez-le dans des puits de plaque de microtitration avec un milieu de récupération de biofilm contenant de la résazurine, un colorant faiblement fluorescent perméable aux cellules. Couver.
Chez les bactéries métaboliquement actives, les enzymes déshydrogénases réduisent la résazurine de couleur bleue en résorufine fluorescente de couleur rose.
L’absence de conversion de la résazurine indique l’éradication du biofilm, tandis que la conversion en résorupine suggère la présence de cellules viables.
La concentration minimale d’agent antibactérien d’essai, sans conversion de la résazurine, indique la concentration minimale d’éradication du biofilm.
Prenez une plaque neuve de 96 puits et ajoutez 100 microlitres de CRPMI équilibrés à température ambiante dans chaque puits des rangées B à H. Diluez jusqu’à quatre composés d’essai séparément dans 1,0 millilitre de CRPMI jusqu’à 2 fois la concentration finale souhaitée. Ajoutez 200 microlitres de composé un dans les puits A1 à A3, 200 microlitres de composé deux dans les puits A4 à A6, 200 microlitres de composé trois dans les puits A7 à A9 et 200 microlitres de composé quatre dans les puits A10 à A12.
Diluez en série les composés d’essai à l’aide d’une pipette multicanaux. Commencez par transférer 100 microlitres de la rangée A à la rangée B et mélangez. De cette manière, continuez à transférer 100 microlitres de puits à bien. Mélangez après chaque transfert et arrêtez-vous dans la rangée F. Après le mélange, expulsez 100 microlitres de la rangée F dans un conteneur à déchets. Ne transférez aucun liquide dans les rangées G et H. Enfin, ajoutez 100 microlitres de CRPMI dans chaque puits de la plaque à l’aide d’une pipette multicanaux, pour porter le volume final à 200 microlitres.
Ajoutez 200 microlitres de solution saline tamponnée au phosphate dans une plaque fraîche et stérile de 96 puits qui comporte des puits de dimensions identiques à celles de la plaque d’initiation du biofilm. Ensuite, retirez le sac en plastique et le film de paraffine de la plaque d’initiation du biofilm incubé. Soulevez le couvercle vers le haut, en évitant tout contact entre les chevilles et le fond de la plaque, car cela pourrait endommager le biofilm. Conservez la partie inférieure pour l’analyse ultérieure de l’OD600.
Rincez les cellules planctoniques en plaçant le couvercle de la cheville sur la plaque contenant le PBS. Immergez les piquets pendant 5 secondes, retirez-les du PBS et immergez-les une fois de plus, en faisant attention de ne pas heurter les piquets contre les côtés du puits. Placez le couvercle de la cheville rincé dans la plaque de défi. Évitez tout contact inutile entre les chevilles et la plaque inférieure, car cela endommagerait le biofilm, ce qui entraînerait des résultats incohérents.
Scellez la plaque avec un film de paraffine et placez-la dans un sac en plastique refermable comme précédemment. Incuber la plaque sans secouer pendant 24 heures à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone. Prenez le bas de la plaque d’initiation du biofilm et remettez les bactéries en suspension dans chaque puits à l’aide d’une pipette multicanaux. Mesurez la DO600 à l’aide d’un lecteur de microplaques approprié pour confirmer la croissance dans tous les puits, mais la stérilité est contrôlée dans la rangée H.
Utilisez un lecteur de plaques équipé d’une chambre d’incubation et capable de prendre des lectures de fluorescence cinétique pour détecter la conversion de la résazurine. Mettre en place une mesure de fluorescence cinétique sur 24 heures à l’aide d’une excitation de 530 nanomètres et d’une émission de 590 nanomètres. Réglez la température de la chambre à 37 degrés Celsius et faites lire la plaque toutes les 20 minutes.
Réglez le lecteur de plaques sur la mesure à partir du bas de la plaque, selon les instructions du fabricant. Préparez-vous à laver la plaque en ajoutant 200 microlitres de PBS dans chaque puits d’une plaque stérile de 96 puits avec une pipette multicanaux. Ensuite, préparez le milieu de récupération du biofilm en ajoutant 400 microlitres de solution mère de résazurine de 0,8 milligramme par millilitre à 20 millilitres de milieu CRPMI, jusqu’à une concentration finale de 16 microgrammes par millilitre de résazurine.
Ensuite, ajoutez 150 microlitres de milieu de récupération du biofilm avec une pipette multicanaux, dans chaque puits d’une plaque fraîche de 96 puits. Transférez la plaque de défi de l’incubateur dans une armoire de biosécurité et retirez délicatement le sac en plastique et le film d’étanchéité. Retirez le couvercle de la cheville de la plaque de défi et rincez les cellules planctoniques dans le PBS comme précédemment, en gardant le bas de la plaque de défi pour l’analyse ultérieure de l’OD600.
Après le rinçage, placez le couvercle de la cheville dans le fond de la plaque contenant le milieu de récupération du biofilm. Enveloppez le côté de la plaque avec un film de paraffine, en faisant attention de ne pas obstruer le fond des puits périphériques. Immédiatement après avoir enveloppé la plaque, placez-la sur le lecteur de plaque et démarrez une lecture cinétique sur une période de 24 heures en lançant le protocole cinétique de resazurine précédemment conçu.