Une coloration immunohistochimique pour la détection des antigènes du virus de la rage

Commencez par une diapositive portant une section de tissu cérébral de souris infectée par le virus de la rage fixée au formol et contenue dans de la paraffine. La section fixe retient les antigènes viraux via la réticulation des protéines.

Traitez la lame avec une solution de xylène pour éliminer la paraffine.

Immergez la lame dans des concentrations décroissantes d’éthanol pour réhydrater les tissus, ce qui les rend compatibles avec les solutions aqueuses.

Introduire un tampon contenant de la protéase pour perturber les liaisons croisées des protéines, améliorant ainsi l’accessibilité de l’antigène.

Immergez-vous dans du peroxyde d’hydrogène pour bloquer les peroxydases endogènes et appliquez une solution bloquante pour éviter les interactions non spécifiques.

Introduire des anticorps primaires spécifiques de l’antigène de la rage, formant des complexes antigène-anticorps.

Ajoutez des anticorps secondaires biotinylés, qui se lient aux anticorps primaires. Incuber avec des enzymes peroxydases conjuguées à la streptavidine, qui interagissent avec la biotine.

Introduire un substrat de peroxydase, produisant un précipité rouge magenta.

Contre-colorez le tissu avec une coloration nucléaire, suivie d’un agent bleuissant, colorant les noyaux en bleu.

L’image d’immunohistochimie révèle des taches rouge magenta dans le cytoplasme, confirmant la présence d’antigènes de la rage dans la coupe tissulaire.

À l’aide d’un microtome, faites une section de paraffine de 5 micromètres. Faites flotter la section sur un bain-marie à 38 degrés Celsius et rassemblez-la sur des lames de verre. Étiquetez les lames à l’aide d’un stylo résistant aux réactifs. Placez les lames sur un plateau et faites-les fondre dans un four à 55 à 60 degrés Celsius pendant une heure.

Ensuite, sortez les lames du four et déparaffinez-les immédiatement à l’aide de trois rinçages consécutifs au xylène de cinq minutes chacun. Après cela, réhydratez les sections de la lame par immersions séquentielles dans des dilutions décroissantes d’éthanol dans de l’eau désionisée, comme indiqué dans le protocole de texte.

Traitez les lames avec la protéase pendant 30 minutes pour la récupération de l’antigène protéolytique, puis rincez les lames avec du PBST pendant 10 minutes et traitez-les avec du peroxyde d’hydrogène à 3 % pendant 10 minutes. Après cela, lavez à nouveau les lames avec du PBST pendant 10 minutes.

Pour commencer, retirez une lame du tampon, en vous assurant de ne manipuler qu’une seule lame à la fois, tandis que les autres restent immergées, et utilisez une serviette en papier pour éponger l’excès de tampon autour de la section du tissu. Placez les lames dans une chambre d’humidité et incubez avec du sérum de chèvre normal à température ambiante pendant 15 minutes.

Ensuite, incubez les lames dans la chambre d’humidité avec la dilution prédéterminée optimale des anticorps antirabiques primaires et des anticorps de contrôle négatif à température ambiante pendant 60 minutes, sans lavage entre les deux. Après cela, lavez les lames avec du PBST pendant 10 minutes et incubez dans une chambre humide avec l’anticorps biotinylé à température ambiante pendant 15 minutes.

Lavez à nouveau les lames avec du PBST pendant 10 minutes. Incuber les lames dans une chambre d’humidité avec le complexe streptavidine-HRP à température ambiante pendant 15 minutes et laver le PBST pendant 10 minutes. Ensuite, incubez avec AEC dans une chambre d’humidité à température ambiante pendant 10 minutes. Lavez les lames dans de l’eau déminéralisée pendant 10 minutes et contre-colorez avec de l’hématoxyline de Gill diluée 1 à 2 avec de l’eau désionisée pendant deux minutes.

Après cela, rincez l’excès d’hématoxyline en rinçant les lames dans de l’eau déminéralisée. Rincez les lames à l’eau du robinet de Scott pendant 30 secondes et lavez-les à l’eau déminéralisée pendant 10 minutes. Retirez les lames une par une et montez-les avec un support de montage soluble dans l’eau. Ensuite, utilisez un microscope optique pour lire les lames.