Utilisation de sondes de tension basées sur l’ADN pour évaluer les forces des récepteurs appliquées par les cellules immunitaires

Commencez avec une lamelle en verre fonctionnalisée avec des nanoparticules d’or ancrées au polyéthylène glycol.

Ajoutez des sondes de tension en épingle à cheveux à ADN contenant une épingle à cheveux à ADN hybridée avec deux oligonucléotides dans des bras opposés.

Le brin ligand comprend un fluorophore et de la biotine, tandis que le brin d’ancrage contient un quencher et un groupe thiol. Dans cette configuration, le quencher supprime la fluorescence.

Les sondes d’ADN se lient aux nanoparticules d’or, s’ancrant à la lamelle de verre.

Introduire la streptavidine, en interagissant avec les molécules de biotine des brins de ligand.

Ajoutez des ligands biotinylés qui se lient aux molécules de streptavidine préliées.

Recouvrir la lamelle avec des lymphocytes T CD8 positifs ; leurs récepteurs interagissent avec les ligands immobilisés, formant un site d’interaction récepteur-ligand.

Cette interaction génère une force qui déplie la structure de l’épingle à cheveux de l’ADN, séparant le fluorophore du quencher et favorisant l’émission de fluorescence.

Introduisez des brins verrouillables non fluorescents qui interagissent avec les segments dépliés des sondes pour préserver le signal de fluorescence.

Quantifier la fluorescence pour évaluer les forces réceptrices appliquées par les cellules immunitaires.

Pour commencer, placez les lamelles de 25 millimètres sur un support en polytétrafluoroéthylène dans un bécher de 50 millilitres et rincez les lamelles trois fois en les immergeant dans l’eau. Mélangez des volumes égaux d’éthanol et d’eau, et ajoutez 40 millilitres de cette solution dans le bécher contenant le support et les lamelles. Ensuite, scellez le bécher à l’aide de ruban adhésif.

Nettoyez les lamelles en sonisant le bécher pendant 15 minutes dans un nettoyeur à ultrasons, et jetez le liquide après la sonication. Ensuite, rincez le bécher contenant la grille et les lamelles avec de l’eau, au moins six fois pour éliminer tout solvant organique restant. Pour préparer une solution fraîche de piranha, ajoutez 30 millilitres d’acide sulfurique dans un bécher de 50 millilitres et ajoutez lentement 10 millilitres de peroxyde d’hydrogène. Mélangez délicatement la solution de piranha à l’aide de l’extrémité d’une pipette en verre.

Pour commencer la gravure, transférez le support contenant les lamelles dans le bécher contenant la solution de piranha, et incubez pendant 30 minutes à température ambiante pour nettoyer et hydroxyler les lamelles. Ensuite, transférez le support à l’aide d’une pince à épiler en acier ou en polytétrafluoroéthylène dans un bécher propre de 50 millilitres et rincez à l’eau six fois. Afin d’éliminer complètement l’eau, plongez la grille contenant les lamelles dans un bécher de 50 millilitres avec 40 millilitres d’éthanol, puis jetez l’éthanol.

Ensuite, plongez la grille dans 40 millilitres d’éthanol contenant 3 % d’aminopropyl triéthoxy silane pendant 1 heure à température ambiante pour initier la réaction avec le groupe hydroxyle sur les lamelles. Rincez la surface de la lamelle six fois en les immergeant dans 40 millilitres d’éthanol, et séchez-les dans un four à 80 degrés Celsius pendant 20 minutes.

Couvrez le fond intérieur de la boîte de Pétri avec du ruban adhésif pour éviter que les lamelles ne glissent à l’intérieur de la boîte de Pétri. Ensuite, placez les lamelles recouvertes d’amines avec le côté à fonctionnaliser avec les sondes de tension d’ADN vers le haut. Couvrez les lamelles à moins 20 degrés Celsius pour une utilisation future.

Pour modifier les groupes amines sur les lamelles, ajoutez de l’acide lipoïque-PEG-NHS et du mPEG-NHS et incubez la boîte de Pétri à température ambiante pendant 1 heure. À la fin de l’incubation, rincez la surface trois fois à l’eau. Après cela, ajoutez 100 microlitres de bicarbonate de sodium 0,1 molaire contenant 1 milligramme par millilitre d’acétate de sulfo-NHS à un ensemble de lamelles sandwich, et incubez pendant 30 minutes pour que la passivation se produise.

Ajoutez 0,5 millilitre de nanoparticules d’or dans chaque lamelle et incubez pendant 30 minutes à température ambiante. Après l’incubation, rincez les lamelles à l’eau trois fois. Après avoir ajouté le brin d’extinction de trou noir 2 à la sonde de tension d’ADN recuit dans un rapport de 10 pour 1, ajoutez 100 microlitres du mélange par deux lamelles pour faire le sandwich.

Placez soigneusement une boule de tissu de laboratoire humide dans la boîte de Pétri, à l’écart des lamelles, et scellez la boîte avec du ruban adhésif pour éviter que la solution ne sèche. Après cela, couvrez le plat d’une feuille d’aluminium et incubez-le à 4 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, assemblez la chambre d’imagerie en prenant soin d’éviter les fissures de surface tout en serrant la chambre. Ensuite, ajoutez 0,5 à 1 millilitre de solution saline équilibrée de Hank dans la chambre d’imagerie.

Utilisez le canal Cy3B avec un objectif 100x pour capturer les signaux fluorescents des cellules plaquées sur les sondes de tension en épingle à cheveux de l’ADN lorsqu’elles commencent à se propager. Après avoir préparé 100 micromolaires non fluorescents à brins verrouillables, au point de temps souhaité, ajoutez-le aux cellules à une concentration finale de 1 micromolaire dans la chambre d’imagerie pour stocker le signal de tension, et mélangez-le avec les cellules par pipetage.

Après environ 10 minutes de verrouillage, acquérez des vidéos en accéléré ou des images de point final en épifluorescence pour la cartographie qualitative de la tension et l’analyse quantitative.