Un test basé sur le CFSE pour surveiller la migration des cellules dendritiques de la peau vers les ganglions lymphatiques drainants chez des souris infectées

Prenez une souris anesthésiée. Injectez la suspension de BCG de Mycobacterium bovis dans le coussinet de la patte arrière.

Les cellules dendritiques de la peau reconnaissent et phagocytent les mycobactéries.

De plus, les composants mycobactériens traités sont présentés sur des molécules de CMH de classe II.

Injectez le colorant CFSE perméable aux cellules dans le même coussinet plantaire.

Les estérases intracellulaires clivent le CFSE en un produit fluorescent imperméable aux cellules, colorant les cellules.

De plus, les cellules dendritiques activées migrent via les vaisseaux lymphatiques vers le ganglion lymphatique poplité, activant les lymphocytes T.

Exciser chirurgicalement le ganglion lymphatique poplité et l’homogénéiser à travers une passoire, obtenant une suspension unicellulaire.

Centrifugez et remettez les cellules en suspension dans un tampon.

Transférez les cellules dans un tube de cytométrie en flux. Centrifugez et traitez les cellules avec un cocktail d’anticorps.

Les anticorps bloquants de Fc bloquent les récepteurs Fc, tandis que les anticorps marqués au fluorophore se lient aux marqueurs de surface CD11c et aux molécules de classe II du CMH sur les cellules immunitaires.

À l’aide de la cytométrie en flux, identifiez les cellules dendritiques cutanées marquées au CFSE avec une expression élevée du CMH-II et une faible expression de CD11c, confirmant ainsi leur migration vers le ganglion lymphatique.

Pour l’injection de BCG de Mycobacterium bovis, après avoir confirmé le niveau approprié de sédation par pincement des orteils, utilisez une seringue équipée d’une aiguille d’un demi-pouce de calibre 29 pour inoculer le coussinet postérieur d’une souris âgée de 8 à 12 semaines avec 1 x 10⁶ unités formant colonies de la bactérie et 30 microlitres de PBS. Injectez les repose-pieds de commande avec PBS uniquement. Ensuite, surveillez les animaux jusqu’à ce qu’ils soient complètement allongés et capables de mettre du poids sur le repose-pieds injecté.

Pour l’injection de CFSE, au moment approprié après l’injection de BCG, diluez dix fois un flacon de CFSE 5 millimolaires à température ambiante dans du PBS, en prenant soin de remettre la solution en suspension à fond. Ensuite, chargez la seringue avec le CFSE dilué et administrez 20 microlitres dans le même coussinet de l’arrière-pied qui a reçu la première injection. 24 heures après l’injection de CFSE, faites soigneusement une incision verticale dans la cuisse arrière et nettoyez la graisse musculaire.

Ensuite, utilisez des ciseaux et une pince à épiler pour exposer et exciser le ganglion lymphatique poplité, situé profondément dans la poche graisseuse au creux du genou. Transférez le ganglion lymphatique dans 0,5 millilitre de PBS stérile sur de la glace et homogénéisez le ganglion lymphatique à travers une crépine cellulaire de 70 microns à l’intérieur d’un puits d’une plaque à six puits contenant 5 millilitres de PBS avec l’extrémité arrière d’une seringue de 3 millilitres. Lavez la passoire avec encore 5 millilitres de tampon et transférez la solution cellulaire dans un tube de 15 millilitres. Ensuite, centrifugez les cellules et remettez la pastille en suspension dans un volume suffisant de tampon.

Pour marquer les cellules pour la cytométrie en flux, aliquote 1 à 10 x 10⁶ cellules dans des tubes ronds en polystyrène à fond rond de 5 millilitres et lavez les cellules dans un tampon FACS frais. Remettre les pastilles en suspension dans 50 à 100 microlitres du cocktail d’anticorps approprié contenant des CD16/CD32 anti-souris pour bloquer les interactions non spécifiques médiées par Fc et un tampon FACS sur de la glace, à l’abri de la lumière. Après 30 à 45 minutes, lavez les cellules dans un tampon FACS et remettez les granulés en suspension dans 50 à 100 microlitres de tampon FACS frais.