JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 vues • 2:22 min • July 8th, 2025
Commencez avec une parabole d’imagerie à base de verre contenant une suspension de neutrophiles humains – ou cellules immunitaires – et visualisez-la sous un système d’imagerie par fluorescence.
Introduisez des conidies rapporteures d’Aspergillus fluorescentes génétiquement modifiées - ou des spores fongiques, et capturez des images à intervalles réguliers jusqu’à 6 heures.
Les spores fongiques expriment des protéines fluorescentes rouges et sont marquées à l’extérieur avec des fluorophores magenta non dégradables, ce qui permet de distinguer les cellules mortes des cellules vivantes.
Pendant l’incubation, les neutrophiles interagissent avec les molécules associées aux agents pathogènes sur les conidies par le biais de récepteurs de reconnaissance de formes, facilitant ainsi leur engloutissement dans un phagosome.
Plus tard, le phagosome fusionne avec le lysosome contenant l’enzyme, formant un phagolysosome.
À l’intérieur du phagolysosome, les espèces réactives de l’oxygène et les enzymes dégradent les conidies.
Au cours de l’imagerie de cellules vivantes, au point temporel initial, une fluorescence rouge et magenta intense dans le phagosome des neutrophiles indique la présence de conidies vivantes.
Au fil du temps, une diminution de la fluorescence rouge avec la rétention de la fluorescence magenta indique la dégradation des conidies, confirmant l’activité antifongique des neutrophiles.
Pour visualiser DsRed et AlexaFlour 633 pendant la microscopie, préchauffez un chauffage de microscope et allumez le microscope et l’ordinateur. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de 3 fois 10 à 6 par millilitre de suspension conidique FLARE dans les puits appropriés de la boîte d’imagerie. Enregistrez l’heure à laquelle les conidies FLARE sont ajoutées.
Montez la parabole d’imagerie sur la platine du microscope. Ensuite, dans les paramètres d’acquisition, réglez la puissance laser sur 10 % et le temps d’exposition sur une seconde, ajustez la sensibilité de l’appareil photo pour une image claire mais non surexposée de DsRed et AF 633, et configurez une liste de points de scène. Initialisez l’imagerie lorsque tous les points sont nets, que les canaux fluorescents sont optimisés et que le temps et la durée du cycle sont réglés.