Un test cellulaire pour l’identification d’agents interagissant avec CXCR4

Prenez une plaque multipuits recouverte de gélatine contenant des cellules cancéreuses du cerveau humain adhérentes exprimant CXCR4.

Remplacez le support par un colorant sensible au calcium. Les estérases intracellulaires clivent le colorant en un produit imperméable à la membrane qui se lie aux ions calcium, présentant une fluorescence accrue.

Retirez le colorant, lavez et ajoutez du tampon.

Placez la plaque dans un lecteur de microplaques à fluorescence avec un composé interagissant avec CXCR4 et des plaques contenant des plaques contenant des chimiokines CXCL12.

À l’aide de paramètres automatisés définis, injectez des concentrations croissantes de composés dans les puits d’essai, suivies d’une concentration spécifique de CXCL12.

Dans les puits de contrôle sans composé, CXCL12 se lie à CXCR4.

Cette liaison active une cascade de signalisation, libérant des ions calcium dans le cytoplasme, où ils se lient au colorant, intensifiant ainsi la fluorescence.

Cependant, dans les puits d’essai, les composés en interaction inhibent la liaison de CXCL12 à CXCR4, affectant la mobilisation du calcium et provoquant une diminution de la fluorescence dose-dépendante, confirmant qu’ils sont des antagonistes de CXCR4.

Le jour du passage des cellules, enduire chaque puits d’une plaque de polystyrène à 96 puits à paroi noire à fond transparent avec 100 microlitres de solution de gélatine à 0,1 %, et incuber les plaques pendant deux heures à température ambiante. Pendant que la gélatine se solidifie, utilisez une solution de trypsine-EDTA pour soulever les cellules d’intérêt du fond de leur flacon de culture, en les remettant en suspension dans un milieu de croissance frais dans un tube conique de 50 millilitres une fois qu’elles se sont détachées.

Après le comptage, collectez les cellules par centrifugation et remettez en suspension la pastille dans un milieu de croissance frais jusqu’à une concentration de 1 x 10⁵ cellules viables par millilitre. Lorsque les plaques sont prêtes, jetez tout excès de solution de gélatine et séchez-les sur un mouchoir de laboratoire. Ensuite, lavez les puits avec 200 microlitres de PBS, et remplacez le lavage par 200 microlitres de cellules par puits, pour une incubation d’une nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Le lendemain matin, tapotez l’assiette pour jeter le milieu de croissance des puits et séchez l’assiette à l’envers sur une serviette en papier. Ensuite, étiquetez les cellules de chaque puits avec 100 microlitres de solution de colorant de chargement par puits et incubez la plaque pendant 45 minutes dans l’obscurité à température ambiante. Pendant que les cellules sont en incubation, ajoutez 75 microlitres de CXCL12 par puits dans la plaque de chimiokine, et 50 microlitres du composé d’intérêt dans chaque puits de la plaque composée.

Ensuite, allumez l’unité de refroidissement du lecteur de plaques de fluorescence, puis le lecteur de plaques lui-même. Après avoir laissé le système démarrer pendant quelques minutes, ouvrez le logiciel du lecteur de plaques. Pour configurer le protocole de test, sous l’onglet Paramètres, sélectionnez Mode de lecture et la longueur d’onde d’excitation et d’émission appropriée pour le colorant de chargement.

Sélectionnez l’onglet « Mélange avec fluide de transfert » pour le mélange automatique des composés dans la plaque de composé. Dans l’onglet « Fluide de transfert », placez 20 microlitres de chaque puits de la plaque composée à transférer dans la plaque de mesure, et positionnez les pointes de pipette à 20 microlitres sous la surface du liquide. Réglez la vitesse d’aspiration à 50 microlitres par seconde et la vitesse de distribution à 25 microlitres par seconde et cliquez sur « Lire avec liquide de transfert ».

Au cours du premier intervalle, sélectionnez 60 lectures avec un intervalle de lecture d’une seconde avec 10 lectures à enregistrer avant que les composés ne soient distribués dans la plaque de mesure, et 50 lectures à terminer après. Définissez le deuxième intervalle avec un intervalle de lecture de 30 secondes et 18 lectures. Sélectionnez trois lavages à pointes pour le protocole, en réglant chaque étape de lavage pour inclure le liquide de lavage approprié, un cycle de lavage, une vitesse de pompe rapide et cinq coups par lavage.

Utilisez la fonction « Pause Pipettor » pour inclure une pause de pipette de 300 secondes et utilisez le réglage « Mélanger avec du liquide de transfert » pour permettre le mélange automatique de la solution CXCL12 dans la plaque de chimiokine. Dans l’onglet « Fluide de transfert » suivant, réglez 25 microlitres de chaque puits de la plaque de chimiokine à transférer sur la plaque de mesure et positionnez les pointes à 20 microlitres sous la surface du liquide. Réglez la vitesse d’aspiration à 50 microlitres par seconde et la vitesse de distribution à 25 microlitres par seconde.

Utilisez le bouton « Lire avec fluide de transfert » pour régler le premier intervalle afin qu’il comprenne 145 lectures avec un intervalle de lecture d’une seconde. Définissez le deuxième intervalle sur un intervalle de lecture de six secondes et 20 lectures. Sélectionnez trois autres cycles d’embouts de lavage, puis cliquez sur « Régler la température de l’étape » et réglez la température de l’appareil sur 37 degrés Celsius.

À la fin de l’incubation du colorant de chargement, jetez le tampon de la plaque de mesure et séchez-la sur un tissu de laboratoire. Lavez les cellules avec 150 microlitres par puits de tampon de dosage, en remplaçant le tampon par 80 microlitres de tampon de dosage après deux minutes. Placez la plaque de mesure en position de lecture, la plaque composée en position source 2, la plaque de chimiokine en position source 3 et une boîte d’embouts noirs en position source 1.

Fermez l’appareil et cliquez sur « Protocol Signal Test » pour déterminer les unités de lumière relatives à l’arrière-plan et les variantes de fluorescence sur la plaque. Sélectionnez Tester « Signal » dans la fenêtre contextuelle. Si des valeurs de fond de 8 000 à 10 000 unités de lumière relatives sont obtenues, sélectionnez « Mettre à jour » et cliquez sur « Enregistrer » pour enregistrer le protocole principal.