Mesure in vitro de l’activité de la α-galactosidase A et de l’enzyme α-glucosidase acide

La α-galactosidase A et la α-glucosidase acide sont des enzymes lysosomales cruciales pour le métabolisme cellulaire.

La α-galactosidase A décompose les substrats tels que les glycolipides, tandis que la α-glucosidase acide hydrolyse le glycogène.

Pour mesurer leur activité enzymatique in vitro, prélever des puits à plaques multipuits avec des échantillons contenant des concentrations connues de α-galactosidase A et de α-glucosidase acide, respectivement.

Ajoutez le volume requis de solutions acides de substrats synthétiques de 4-méthylumbellifèreryl dans les puits, des substrats fluorogéniques spécifiques conçus pour imiter les substrats naturels de ces enzymes.

Incuber dans l’obscurité.

La α-galactosidase A et les enzymes α-glucosidase acide clivent leurs substrats respectifs, libérant le produit fluorescent, la 4-méthylombelliférone.

Ajouter un tampon alcalin pour terminer la réaction enzymatique.

À l’aide d’un lecteur de fluorescence de microplaques, mesurez l’intensité de fluorescence de la 4-méthylumbelliférone dans les puits, indicative de sa concentration, afin de déterminer l’activité enzymatique de la α-galactosidase A et de la α-glucosidase acide, respectivement.

Diluez la quantité calculée de chaque échantillon et pipetez-le dans des tubes de réaction frais de 1,5 millilitre pour obtenir 0,05 microgramme d’alpha-galactosidase A ou 0,5 microgramme d’alpha-glucosidase acide par microlitre de solution. Vortex à nouveau les échantillons pendant 5 secondes, puis pipetez 10 microlitres de cette dilution et dupliquez-les dans une plaque de 96 puits.

Démarrez les réactions en ajoutant 20 microlitres de la solution de substrat respective. Pour l’alpha-galactosidase A, ajouter 2 millimolaires de 4-méthylombelliféryl-alpha-D-galactopyranoside ou 4-MU-Gal dans un tampon de citrate de phosphate 0,06 molaire, pH 4,7. Pour l’alpha-glucosidase acide, ajouter 2 millimolaires de 4-méthylumbellifèreryl-alpha-D-glucopyranoside ou de 4-MU-Glu dans de l’acétate de sodium 0,025 molaire, pH 4,0.

Incuber les réactions enzymatiques pendant 1 heure dans l’obscurité à 37 degrés Celsius et 300 tr/min sur un agitateur orbital. Ensuite, terminez la réaction en ajoutant 200 microlitres de tampon d’hydroxyde de sodium de glycine ajusté à pH molaire de 1,0 et 10,5. Préparez une courbe standard de 4-MU à partir d’un stock de 0,01 milligramme par millilitre selon le protocole de texte, et pipetez 10 microlitres des solutions en double dans une plaque de 96 puits.

Ajoutez 200 microlitres de tampon d’hydroxyde de sodium de glycine de 1,0 molaire à chaque puits afin d’ajuster le volume et le pH. Enfin, mesurez l’activité enzymatique dans un lecteur de fluorescence équipé du jeu de filtres approprié et analysez les données à l’aide du logiciel approprié pour le lecteur de fluorescence.