Un test d’attachement viral pour le criblage de composés antiviraux

Commencez avec une plaque multi-puits contenant une monocouche de cellules d’hépatome humain pré-refroidie.

Traitez les puits d’essai avec un mélange de virus de l’hépatite C génétiquement modifié portant le gène de la luciférase et d’un composé cible ; traitez les puits de contrôle avec le virus seul.

Dans les puits d’essai, les molécules cibles interagissent avec les glycoprotéines virales et les récepteurs de surface cellulaire, empêchant ainsi l’attachement viral.

Cependant, dans les puits de contrôle, les glycoprotéines virales interagissent avec les récepteurs de surface cellulaire, ce qui permet leur fixation. Une basse température inhibe l’entrée virale.

Retirez le surnageant, introduisez un milieu et incubez à nouveau à la température optimale, facilitant ainsi l’entrée virale.

À l’entrée, le virus libère le matériel génétique, initiant la synthèse des protéines virales et des enzymes luciférase, qui sont sécrétées dans le milieu.

Transférez le surnageant contenant de la luciférase et introduisez un substrat.

L’interaction enzyme-substrat produit de la lumière proportionnellement aux niveaux de luciférase.

L’intensité lumineuse plus faible dans les puits de test, par rapport aux puits de contrôle, indique la propriété antivirale du composé cible.

Pour le test de fixation virale, mettre en plaque 1 x 10⁴ cellules par puits dans une plaque de 96 puits et incuber pendant la nuit pour la fixation cellulaire. Le lendemain matin, refroidissez d’abord la plaque de 96 puits contenant la monocouche cellulaire à 4 degrés Celsius pendant 1 heure.

Préparez les composés d’essai et le mélange de virus sur de la glace. Par exemple, des solutions HCV-CHLA, HCV - 1 % DMSO ou des solutions d’héparine HCV-témoin positif avec 10² virus FFU pour chaque bien de traitement. Aspirez doucement le milieu des puits de culture cellulaire. Ensuite, ajoutez immédiatement 100 microlitres de mélange de composés de test de virus dans des puits en trois exemplaires, en prenant soin de ne pas augmenter la température. Incuber l’assiette dans un réfrigérateur maintenu à 4 degrés Celsius pendant trois heures.

Les particules virales se fixent à la surface de la cellule à 4 degrés Celsius, mais ne sont pas internalisées. Ensuite, aspirez les surnageants. Lavez doucement les cellules deux fois avec 200 microlitres de PBS glacé. Ajoutez 100 microlitres de milieu de base dans chaque puits, puis incubez à 37 degrés Celsius pendant 72 heures. Enfin, pour quantifier le rapporteur de la luciférase libéré par les cellules infectées, prélevez bien le surnageant de chaque échantillon et effectuez le dosage de la luciférase gaussiale.