Un test pour évaluer l’effet des composés testés sur l’entrée virale et la fusion dans les cellules hôtes

Prenez des cellules cancéreuses du foie et incubez-les à basse température pour altérer l’endocytose.

Introduire un virus de l’hépatite C recombinant ou VHC, composé d’un génome d’ARN modifié codant pour un rapporteur de luciférase sécrété.

Les lipoprotéines virales interagissent avec les protéoglycanes des cellules hôtes, tandis que les glycoprotéines de l’enveloppe virale se lient à des récepteurs spécifiques de l’hôte.

Dans les puits sélectionnés, ajoutez le composé d’essai qui se lie aux glycoprotéines virales.

Lors de l’incubation à température physiologique, les virus liés sont endocytosés.

Jetez les virus non internalisés, ajoutez un milieu de croissance et incuberez.

Dans les puits non traités, les glycoprotéines favorisent la fusion enveloppe-endosome viral, libérant la nucléocapside, tandis que le masquage composé nuit à la fusion dans les puits traités.

Lors de sa libération, l’ARN exprime des protéines virales, y compris la luciférase qui est sécrétée extracellulairement.

Récoltez le surnageant contenant de la luciférase et ajoutez un substrat bioluminescent, qui est oxydé par la luciférase pour émettre de la lumière.

Une diminution de la luminescence dans les puits traités par rapport aux puits non traités indique une inhibition de la fusion enveloppe virale-endosome.

Pour mesurer la fusion virale et l’entrée, pré-refroidissez la plaque de culture cellulaire à 4 degrés Celsius pendant une heure après l’incubation pendant la nuit pour la fixation des cellules. Retirez le milieu existant des puits et infectez les cellules avec 10 à deux FFU, le VHC, sur de la glace.

Incuber la plaque à 4 degrés Celsius pendant trois heures. Lavez doucement les cellules deux fois avec 200 microlitres de PBS glacé pour éliminer le virus non adhérent. Ensuite, sur de la glace, traitez les cellules avec un composé d’essai dissous dans un milieu basal ou un milieu basal avec 1 % de DMSO comme témoin, et incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant trois heures. Cela permet d’évaluer les composés d’essai lors de l’entrée virale, qui se produit à 37 degrés Celsius.

Aspirez le milieu et lavez deux fois les virus non internalisés avec 200 microlitres de tampon de citrate ou PBS. Ajoutez 100 microlitres de milieu de base par puits et incubez à 37 degrés Celsius pendant encore 72 heures. Prélever le surnageant et effectuer le dosage de la luciférase gaussiase comme démontré précédemment pour détecter le rapporteur de luciférase libéré.