Encyclopédie des expériences JoVE
Immunologie
0 vues • 3:04 min • July 8th, 2025
Commencez par un ADN clivage de l’ARNAzyme, un ADN catalytique qui, en se liant à un biomarqueur bactérien spécifique, est activé.
L’ADN est lié à une perle magnétique enrobée de streptavidine via la biotine à son extrémité 5'. À l’extrémité 3', il est lié à une uréase liée à un oligonucléotide, formant une bille magnétique fonctionnelle.
À un tube contenant des billes magnétiques fonctionnelles, ajoutez un lysat d’E. coli.
Un biomarqueur spécifique d’E. coli du lysat active l’ADN zymé, déclenchant le clivage de la liaison ARN, provoquant le détachement du conjugué ADNenzyme-uréase.
Utilisez un support magnétique pour immobiliser les billes et retirer le conjugué DNAzyme-uréase lié aux billes.
Transférez le surnageant contenant de l’uréase libéré dans un autre tube.
Ajoutez un colorant indicateur de pH - rouge de phénol - et une solution d’urée.
L’uréase hydrolyse l’urée en ammoniac et en dioxyde de carbone.
L’ammoniac, une base faible, augmente le pH de la solution, provoquant un changement de couleur, ce qui indique la présence du biomarqueur E. coli.
Après avoir préparé des cellules E. coli selon le protocole de texte, prélaver un tube de microfuge de 1,5 millilitre en ajoutant et en vortex 100 microlitres de RB. Ensuite, jetez la mémoire tampon.
Ajoutez 15 microlitres d’EC1 assemblé dans le tube lavé, puis placez le tube sur le support magnétique et aspirez le surnageant. Retirez le tube du support, ajoutez 100 microlitres de RB et remettez soigneusement les billes magnétiques en suspension.
Après avoir utilisé RB pour laver les billes deux fois de plus et retiré le RB, ajoutez 10 microlitres de l’échantillon d’E. coli dans le tube et mélangez doucement le contenu en tapotant sur le tube. Ensuite, incubez la réaction à température ambiante pendant une heure.
Après l’incubation, ajoutez 90 microlitres d’eau doublement distillée et placez le tube sur la grille magnétique. Après environ trois minutes de séparation magnétique, transférez soigneusement 85 microlitres de surnageant dans un tube de microfuge de 0,5 millilitre.
Il est très important de pipeter la solution avec précaution sans prélever de billes magnétiques. Ces billes sont chargées d’uréase et vont générer un signal faux positif.
Ajouter 15 microlitres de rouge de phénol à 0,04 % et 100 microlitres de solution de substrat. Ensuite, prenez des photos à des intervalles de temps précis pour enregistrer un changement de couleur.