Encyclopédie des expériences JoVE
Immunologie
0 vues • 4:07 min • July 8th, 2025
Prenons l’exemple de complexes de transfection comprenant des ARNm rapporteurs codant pour la luciférase de luciole, ou Fluc, et la Renilla luciférase, ou Rluc.
L’ARNm Fluc contient une séquence de polyadénosine 5', ou un leader poly(A), tandis que l’ARNm Rluc n’a pas cette séquence.
Transfectez des cellules de mammifères non infectées et infectées par le poxvirus pour délivrer les ARNm rapporteurs, puis incuberez.
Dans les cellules non infectées, les facteurs d’initiation eucaryotes se lient à la coiffe 5' de l’ARNm, suivis du recrutement de la petite sous-unité ribosomique et d’un ARNt initiateur.
Lorsque la petite sous-unité localise le codon de départ, la grande sous-unité se joint pour synthétiser les protéines de la luciférase.
Dans les cellules infectées, la phosphorylation de la petite sous-unité médiée par le poxvirus provoque l’assemblage du ribosome directement sur la séquence leader, ce qui augmente la production de Fluc.
Lyse les cellules pour libérer les luciférases.
Ajoutez le substrat Fluc, que l’enzyme oxyde, émettant de la lumière. À l’aide d’un lecteur de plaques, mesurez la luminescence.
Répétez l’étape pour Rluc afin de déterminer l’augmentation relative de la
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