Un test rapporteur de luciférase pour étudier la régulation de la traduction dans des cellules infectées par des poxvirus

Prenons l’exemple de complexes de transfection comprenant des ARNm rapporteurs codant pour la luciférase de luciole, ou Fluc, et la Renilla luciférase, ou Rluc.

L’ARNm Fluc contient une séquence de polyadénosine 5', ou un leader poly(A), tandis que l’ARNm Rluc n’a pas cette séquence.

Transfectez des cellules de mammifères non infectées et infectées par le poxvirus pour délivrer les ARNm rapporteurs, puis incuberez.

Dans les cellules non infectées, les facteurs d’initiation eucaryotes se lient à la coiffe 5' de l’ARNm, suivis du recrutement de la petite sous-unité ribosomique et d’un ARNt initiateur.

Lorsque la petite sous-unité localise le codon de départ, la grande sous-unité se joint pour synthétiser les protéines de la luciférase.

Dans les cellules infectées, la phosphorylation de la petite sous-unité médiée par le poxvirus provoque l’assemblage du ribosome directement sur la séquence leader, ce qui augmente la production de Fluc.

Lyse les cellules pour libérer les luciférases.

Ajoutez le substrat Fluc, que l’enzyme oxyde, émettant de la lumière. À l’aide d’un lecteur de plaques, mesurez la luminescence.

Répétez l’étape pour Rluc afin de déterminer l’augmentation relative de la luminescence de Fluc par rapport à Rluc dans les cellules infectées par le virus.

Ensemencez les cellules HeLa dans une plaque de 24 puits pour atteindre une confluence de 80 % à 90 % le lendemain, et incubez pendant la nuit dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Infectez les cellules HeLa avec le virus de la vaccine à une multiplicité d’infection de 5 et conservez les cellules HeLa non infectées à des fins de comparaison, puis incubez la plaque à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 10 à 12 heures. Après les heures souhaitées après l’infection, mélangez 480 nanogrammes d’ARNm de luciférase de luciférase portant la séquence 12A et 20 nanogrammes d’ARNm de Renilla luciferase portant la séquence Kozak dans un tube de microcentrifugation.

Dans un autre tube de microcentrifugation, ajoutez 1,1 microlitre de réactif de transfection lipidique cationique. Ajoutez 55 microlitres de sérum réduit dans les deux tubes. Mélangez et incubez à température ambiante pendant 5 minutes. Ensuite, ajoutez 55 microlitres de réactif de transfection lipidique cationique contenant un milieu sérique réduit dans un tube contenant de l’ARNm. Mélangez doucement mais soigneusement à l’aide d’une pipette et laissez incuber à température ambiante pendant 15 minutes. Pendant l’incubation, retirez le milieu de culture cellulaire des cellules et ajoutez 400 microlitres de milieu sérique réduit par puits.

Lorsque l’incubation est terminée, ajoutez 100 microlitres du mélange goutte à goutte et uniformément par puits de la plaque de 24 puits. 5 heures après la co-transfection avec 12A-Fluc et l’ARNm de Kozak-Rluc, retirez le milieu sérique réduit des cellules et lysez les cellules en ajoutant 150 microlitres de tampon de lyse 1X du kit de dosage de la luciférase capable d’effectuer deux dosages rapporteurs. Après une incubation de 10 minutes à température ambiante, grattez les cellules à l’aide de caoutchouc et d’une seringue stérile et transférez-les dans un tube de microcentrifugation.

Pour granuler les débris cellulaires, centrifugez le lysat à 12 000 fois g pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius. Transférez 30 microlitres de surnageant par puits d’une plaque d’analyse blanche de 96 puits à paroi opaque avec un fond solide. Utilisez le kit de dosage de la luciférase dans un luminomètre à lecteur de plaque multimode pour mesurer la double luminescence à l’aide de la fonction cinétique décrite dans le manuscrit.