Méthode de microtitration sur plaque pour évaluer la concentration minimale inhibitrice d’un antibiotique

Prenez des plaques de microtitration contenant un antibiotique aminoglycoside dilué en série. L’une des plaques contient du NTBC, une drogue synthétique.

Introduisez Pseudomonas aeruginosa, une bactérie à Gram négatif, et incubez.

Les bactéries produisent de la pyomélanine – un pigment extracellulaire protecteur – dans les puits non traités par le NTBC, tandis que le médicament empêche la production de pyomélanine.

L’antibiotique cationique se lie aux lipopolysaccharides anioniques, ou LPS, sur la membrane externe bactérienne, déplaçant les ponts cationiques et déstabilisant la membrane.

Lorsqu’il pénètre dans la bactérie, l’antibiotique se lie au site aminoacyle, ou site A, dans la sous-unité ribosomique 30S.

L’antibiotique lié empêche la liaison de l’aminoacyl-ARNt et le mouvement ribosomique à travers l’ARNm, interférant avec la synthèse des protéines et inhibant la croissance bactérienne.

Après l’incubation, mesurez la densité optique de la culture pour évaluer la croissance bactérienne.

La concentration minimale d’antibiotiques qui empêche la croissance bactérienne est la concentration minimale inhibitrice ou CMI.

Des valeurs de CMI similaires pour les puits traités et non traités par NTBC indiquent qu’il n’y a pas d’impact du NTBC sur la sensibilité des bactéries aux antibiotiques.

La veille, avant l’essai de CMI, préparer des cultures des souches à tester dans LB avec et sans 2-[2-nitro-4-trifluorométhyl)benzoyl]-1-3 cyclohexanedione ou NTBC. Cette démonstration utilise le niveau représentatif de 300 micromolaires de NTBC. La méthode de titrage permettant de déterminer la concentration appropriée de NTBC est décrite dans le texte du protocole. Incuber les cultures pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec aération. Le lendemain, préparez les solutions maîtresses LB plus NTBC et LB plus DMSO pour le test MIC.

Pour tester un antibiotique pour une souche, ajoutez 600 micromolaires de NTBC à 2 millilitres de LB et mélangez pour obtenir la solution maîtresse de NTBC. Le NTBC est ajouté à une concentration de 600 micromolaires car il sera dilué deux fois lors de l’ajout de l’inoculum, ce qui donne une concentration finale de 300 micromolaires. Ajoutez un volume équivalent de DMSO du véhicule à 2 millilitres de LB et mélangez pour obtenir la solution maîtresse sans NTBC. Ces deux solutions mères seront utilisées pour la création de solutions mères d’antibiotiques ainsi que pour la mise en place de la série de dilution en plaques de 96 puits.

Ensuite, préparez les solutions antibiotiques dans les solutions maîtresses LB plus NTBC ou LB plus DMSO. Préparez la solution mère de gentamicine plus ou moins NTBC à 64 microgrammes par millilitre. Préparez la solution mère de Kanamycin plus ou moins NTBC à 256 microgrammes par millilitre. Préparez la solution mère de tobramycine plus ou moins NTBC à 8 microgrammes par millilitre.

Une fois que les solutions antibiotiques 2X ont été préparées, ajoutez 100 microlitres de chaque solution antibiotique dans quatre puits dans une plaque à 96 puits dans la rangée A. Par exemple, la gentamicine doit être placée dans les catégories A1 à A4. La kanamycine doit être placée dans les couches A5 à A8, et la tobramycine dans les couches A9 à A12.

Ajoutez 50 microlitres de la solution maîtresse LB plus NTBC ou LB plus DMSO aux rangées B à H de la plaque à 96 puits. Assurez-vous qu’une plaque est LB plus NTBC et qu’une plaque est LB plus DMSO. À l’aide d’une tête de micropipette, effectuez des dilutions en série de deux fois des antibiotiques en transférant 50 microlitres de la solution de la rangée A à la rangée B. Mélangez la solution, changez les pointes de la pipette et transférez 50 microlitres de la solution de la rangée B à la rangée C. Répétez l’opération pour les rangées restantes.

Après avoir dilué la rangée G, retirez 50 microlitres de la solution de cette rangée et jetez-la. Utilisez la rangée H comme contrôle sans antibiotique pour la croissance bactérienne. Récupérez les cultures de nuit. Après avoir lavé toutes les cultures pour éliminer la biomélanine présente dans le milieu, mesurez la DO₆₀₀ des cultures. Diluez les cultures de nuit dans LB.

À l’aide d’une micropipette multicanaux, ajoutez 50 microlitres de culture bactérienne diluée dans les puits appropriés. Ajoutez des bactéries dans trois puits pour chaque souche et concentration d’antibiotiques. Ajoutez 50 microlitres de LB dans le quatrième puits pour agir comme un contrôle de la contamination bactérienne. Recouvrez les plaques à 96 puits de parafilm et incubez pendant environ 24 heures à 37 degrés Celsius.

Le lendemain, examinez visuellement les plaques pour détecter la croissance bactérienne dans les puits. La CMI est la concentration la plus faible d’antibiotique dans laquelle aucune croissance bactérienne n’est observée pour les trois réplicats de chaque souche.