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Immunologie
0 vues • 4:10 min • July 8th, 2025
Prenez des puits contenant des hydrogels de polyacrylamide de rigidité variable recouverts de collagène, imitant une matrice extracellulaire physiologique, ou ECM.
Ajoutez des cellules endothéliales microvasculaires qui forment des adhérences focales, ou FA – complexes médiant la liaison cellule-ECM – pour détecter la rigidité de l’hydrogel.
Les hydrogels plus rigides augmentent l’expression à la surface cellulaire de la vimentine, un composant du cytosquelette, par rapport aux hydrogels plus mous.
Ajoutez la bactérie Listeria monocytogenes, conçue pour exprimer une protéine fluorescente sous le promoteur de la protéine inductrice de l’assemblage de l’actine, ou ActA.
Centrifuger pour synchroniser le contact bactérien avec les cellules hôtes, et incuber.
Les bactéries se lient à la vimentine. Plus de vimentine sur les cellules hôtes plus rigides liées à l’hydrogel entraîne une plus grande adhérence bactérienne et une endocytose.
Ajoutez un antibiotique, éliminant les bactéries non internalisées.
Les bactéries internalisées sécrètent des toxines, rompant la membrane de l’endosome. L’échappement cytoplasmique active le promoteur ActA pour exprimer la protéine fluorescente, marquant ainsi les bactéries intracellulaires.
Détacher enzymatiquement les cellules. À l’aide de la cytométrie en flux, détectez une fluorescence plus élevée dans les cellules hôtes résidant sur des hydrogels plus rigides, indiquant une plus grande internalisation bactérienne.
Après avoir préparé une culture nocturne de L. monocytogenes selon le protocole textuel, transférez 1 millilitre de la culture dans un tube de microcentrifugation et faites-le tourner à 2 000 fois g et à température ambiante pendant 4 minutes. Après avoir utilisé du PBS de qualité culture tissulaire pour laver la pastille deux fois, utilisez 1 millilitre de PBS pour remettre la pastille en suspension.
Préparez le mélange d’infection en combinant 10 ou 50 microlitres de suspension bactérienne avec 1 millilitre de milieu complet MCDB-131 pour une multiplicité d’infection, ou MOI, d’environ 50 bactéries par cellule hôte ou 10 bactéries par cellule hôte. Retirez le milieu des puits des plaques de 24 puits en prenant soin de ne pas perturber les hydrogels ou les cellules. Utilisez 1 millilitre de milieu complet MCDB-131 pour laver les cellules une fois, puis ajoutez 1 millilitre de bactéries dans chaque puits.
Placez le couvercle sur les assiettes et enveloppez-les d’un film alimentaire en polyéthylène pour éviter les fuites. Centrifugez les plaques à 2,000 fois g pendant 10 minutes pour synchroniser l’invasion. Ensuite, incubez les cultures à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Avec le milieu complet MCDB-131, lavez les échantillons 4 fois et retournez-les dans l’incubateur de culture tissulaire. Après 30 minutes supplémentaires, remplacez le milieu par du milieu complet MCDB-131 complété par 20 microgrammes par millilitre de gentamicine.
Pour effectuer une cytométrie en flux huit heures après l’infection, retirez le milieu des puits de la plaque à 24 puits et utilisez la culture tissulaire PBS pour laver les puits une fois. Après le retrait du PBS, ajoutez 200 microlitres de mélange trypsine-EDTA-collagénase dans chaque puits. Placez la boîte dans l’incubateur de culture tissulaire pendant 10 minutes pour permettre le détachement complet des cellules.
Après avoir pipeté doucement chaque puits huit fois, ajoutez 200 microlitres de milieu complet pour neutraliser la trypsine. Transférez les 400 microlitres de solution cellulaire de chaque puits dans un tube en polystyrène de 5 millilitres avec un capuchon de crépine de 35 micromètres. Analysez les échantillons par cytométrie en flux.