Détermination de l’efficacité antivirale de médicaments expérimentaux à l’aide d’un test sur plaque

Commencez par un échantillon contenant un virus obtenu à partir d’une cornée porcine infectée traitée avec un médicament antiviral.

Effectuez une dilution en série de l’échantillon pour créer une séquence de concentrations virales décroissantes.

Une dilution optimale empêche l’infection unicellulaire par plusieurs virus.

Introduisez les échantillons dilués dans une monocouche de cellule hôte et incuberez.

Le virus se fixe au récepteur de la cellule hôte, pénètre dans la cellule et initie sa réplication. La cellule infectée lyse, libérant des virions.

Ajoutez de la méthylcellulose, une substance visqueuse qui confine les virus aux cellules voisines.

Par la suite, les virus provoquent la mort cellulaire et la formation de plaques dans la région infectée.

Ajoutez du méthanol pour fixer les cellules.

Utilisez du violet cristallin pour colorer les cellules vivantes.

Observez les plaques comme des zones claires indiquant les cellules infectées et la mort cellulaire, entourées de cellules non infectées colorées au violet cristallin.

Enfin, comptez le nombre de plaques à la dilution la plus élevée pour quantifier le titre viral dans la solution de départ afin de déterminer l’efficacité du médicament antiviral.

Pour quantifier la quantité de virus recueillie dans chaque cornée, préparer une dilution en une fois du virus dans un milieu sans sérum dans des tubes de microcentrifugation jusqu’à ce qu’une dilution de 1 x ^10-8 soit atteinte.

Après avoir aspiré le milieu de croissance de chaque puits de cellules, transférez 1 millilitre de chaque dilution virale, en commençant par 1 x ^10-3 aux monocouches cellulaires en plaques, et placez les cellules infectées dans l’incubateur de culture cellulaire pendant deux heures. À la fin de l’incubation, laver délicatement chaque puits 2 fois avec du PBS avant d’ajouter 2 millilitres de milieu chargé de méthylcellulose dans chaque puits pour une incubation de 72 heures, ou jusqu’à ce que la formation de plaques puisse être observée.

Après observation de la plaque, ajoutez lentement 1 millilitre de méthanol dans le coin de chaque puits pour une incubation de 15 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, aspirez lentement le contenu de chaque puits sans perturber la monocouche cellulaire.

Ensuite, étiquetez chaque puits avec 1 millilitre de solution de travail de violet de cristal, en veillant à ce que toutes les cellules soient couvertes pour une incubation de 30 minutes à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation, jetez la solution et séchez les puits sur une feuille de papier absorbant. Ensuite, comptez le nombre de plaques au puits de dilution le plus élevé pour quantifier la teneur totale en virus dans la solution de départ 3 fois.