Détermination du rôle des cellules de type neutrophile dans la sensibilité des cellules de lymphome à un médicament testé

Prenez une plaque multi-puits contenant des monocultures sphéroïdes 3D de cellules de lymphome, de globules blancs cancéreux et de co-cultures de lymphome et de cellules de type neutrophile dans une matrice de membrane basale.

Ajouter un médicament d’essai qui se lie à la tubuline intracellulaire et perturbe la polymérisation des microtubules, entraînant l’apoptose cellulaire.

Dans la co-culture, le contact direct avec les cellules du lymphome active les cellules de type neutrophile, induisant la sécrétion de cytokines.

Ces cytokines interagissent avec les récepteurs cellulaires du lymphome, déclenchant des cascades de signalisation en aval et régulant à la hausse l’expression des protéines anti-apoptotiques, favorisant ainsi la survie cellulaire.

Jetez le support. Ajouter un tampon de dissociation pour perturber l’adhésion cellulaire.

Grattez les sphéroïdes et incubez-les sous agitation. Transférez la suspension dans des tubes et continuez à agiter pour former des suspensions unicellulaires.

Introduire un cocktail d’anticorps conjugués aux fluorophores qui marque le lymphome et les cellules de type neutrophile.

Ajoutez de l’annexine V marquée au fluorophore et de l’iodure de propidium pour marquer les cellules apoptotiques et mortes.

À l’aide de la cytométrie en flux, détecter une augmentation de la survie des cellules du lymphome dans la co-culture, indiquant une protection médiée par les neutrophiles contre le médicament.

Pour mettre en place une co-culture 3D, ajoutez 50 000 cellules B de lymphome RL seules, ou mélangez-les avec des cellules différenciées par HL60 dans des tubes stériles de 15 millilitres.

Faites tourner les échantillons et remettez les granulés en suspension dans 300 microlitres de matrice de membrane basale à l’aide d’une pointe de pipette de 1 millilitre dont l’ouverture est coupée à 2 à 3 millimètres. Ensuite, incubez 300 microlitres de cellules dans chaque puits d’une plaque de 24 puits pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2.

À la fin de l’incubation, ajoutez 1 millilitre de milieu RPMI complet dans chaque puits, et retournez aux cultures 3D dans l’incubateur pendant sept autres jours avec des changements de milieu tous les deux jours. Le jour 5, ajoutez 10 nanomolaires de vincristine aux cultures.

Après une semaine de culture, aspirez le milieu et lavez bien chaque fois avec 1 millilitre de PBS glacé. Ensuite, ajoutez 3 millilitres de PBS glacé avec EDTA dans chaque puits et raclez le fond des puits avec une pointe de pipette de 200 microlitres pour détacher les gels. Agitez doucement l’assiette sur de la glace pendant 30 minutes. Ensuite, transférez les suspensions cellulaires dans des tubes stériles individuels de 15 millilitres pour les agiter doucement sur de la glace pendant 30 minutes supplémentaires.

Confirmer l’apparition d’une suspension cellulaire homogène. Ensuite, faites tourner les cellules, puis effectuez un lavage PBS, et remettez les granulés en suspension dans du PBS frais avec du FBS. Enfin, marquez les cellules avec les anticorps et les colorants de viabilité appropriés, comme nous venons de le démontrer, et analysez les cellules différenciées par RL et HL60 par cytométrie en flux à l’aide de la stratégie de déclenchement illustrée.