Encyclopédie des expériences JoVE
Immunologie
0 vues • 2:46 min • July 8th, 2025
Prenez une plaque multi-puits avec une culture de cellules souches mésenchymateuses adhérentes, ou CSM.
Ajoutez des cellules mononucléées du sang périphérique, ou PBMC, et incubez.
Les CSM sécrètent un facteur de croissance hépatocytaire, incitant les monocytes à acquérir un phénotype immunomodulateur, produisant de l’interleukine-10 ou IL-10.
Transvasez le surnageant contenant des PBMC dans un tube.
Ajouter des billes magnétiques enrobées d’anticorps se liant au marqueur de surface de monocyte CD14.
Utilisez un séparateur magnétique pour isoler les monocytes CD14+ et ajoutez-les aux puits à plaques multipuits à des concentrations croissantes.
Introduire des lymphocytes T CD4+ effecteurs marqués au CFSE fluorescent.
Ajoutez des microbilles conjuguées à des anticorps qui se lient spécifiquement aux marqueurs de surface des lymphocytes T CD3 et CD28, activant ainsi les cellules.
Dans le contrôle des monocytes bien dépourvus, les lymphocytes T activés prolifèrent, chaque division cellulaire diminuant l’intensité de la fluorescence CFSE dans les cellules filles.
Cependant, dans les co-cultures, les monocytes induits par les CSM sécrètent de l’IL-10, supprimant la prolifération des lymphocytes T effecteurs.
À l’aide de la cytométrie en flux, observer un nombre réduit de lymphocytes T présentant des intensités de fluorescence CFSE réduites avec l’augmentation des concentrations de monocytes, indiquant la suppression de la prolifération des lymphocytes T effecteurs par les monocytes induits par les CSM.
Pour effectuer un essai de suppression des effecteurs, commencez par mettre en place une co-culture MSC-PBMC avec 2,5 x 106 PBMC, co-cultivée avec 250 000 MSC afin d’assurer suffisamment de PBMC co-cultivés MSC pour la sélection de sous-populations.
Après 48 à 72 heures à 37 degrés Celsius, sélectionnez les leucocytes immunomodulateurs induits par les CSM d’intérêt avec les billes magnétiques appropriées. Ensuite, ajoutez des lymphocytes T CD4 positifs allogéniques marqués au CFSE dans 1 millilitre de milieu leucocytaire complet par puits, à divers ratios expérimentaux.
Ensuite, ajoutez des microbilles conjuguées anti-CD3/28 à un rapport bille/cellule de 1 à 1 pour stimuler les lymphocytes T CD4 positifs. Le troisième jour de la co-culture, évaluer la prolifération des lymphocytes T CD4 positifs marqués au CFSE par cytométrie en flux.