Une étude in vitro de l’effet des cellules stromales sur le recrutement des leucocytes

Prenez des chambres d’écoulement pré-assemblées reliées à des systèmes d’écoulement avec des filtres transpuits : l’une avec une monoculture endothéliale en haut et l’autre avec une culture endothéliale en haut et des cellules stromales en bas.

Les deux chambres sont prétraitées avec une cytokine pro-inflammatoire.

Dans une monoculture, les cytokines activent les cellules endothéliales, régulant à la hausse l’expression des molécules d’adhésion.

Cependant, la diaphonie entre les cellules stromales et endothéliales dans la co-culture conduit les cellules stromales à produire des médiateurs régulateurs qui régulent à la baisse la réponse des cellules endothéliales aux cytokines pro-inflammatoires.

Positionnez la chambre sur une platine de microscope à contraste de phase inversé.

Introduire une suspension de neutrophiles.

Les neutrophiles sont recrutés et se lient aux molécules d’adhésion endothéliale via des interactions adhésives transitoires, facilitant leur interaction avec les chimiokines liées à la surface et roulant le long de l’endothélium.

Cette interaction active les intégrines sur les neutrophiles, stabilisant l’adhésion et entraînant une transmigration à travers les cellules endothéliales.

Cependant, dans la co-culture, la réponse endothéliale régulée à la baisse entraîne une suppression du recrutement des neutrophiles.

Visualisez les cultures sous microscopie à contraste de phase pour évaluer le recrutement de neutrophiles à partir du flux.

Pour le modèle à filtre, coupez d’abord un morceau de Parafilm de la même taille que la lamelle en verre, à l’aide d’un gabarit métallique. Ensuite, découpez une fente de 20 x 4 millimètres dans le Parafilm à l’aide d’un gabarit métallique pour créer le canal d’écoulement. Utilisez le joint Parafilm pour marquer le canal d’écoulement sur la lamelle de protection en verre. Alignez les bords du filtre à six puits sur la lamelle de protection en verre. Assurez-vous que le filtre couvre les marquages du canal d’écoulement. Découpez soigneusement le filtre à l’aide d’un scalpel de type 10A.

Ensuite, couvrez soigneusement le filtre avec un joint Parafilm, en vous assurant que la fente du canal d’écoulement se trouve au milieu du filtre. Utilisez un morceau de mouchoir propre et repoussez les bulles. Maintenant, placez la lamelle dans l’évidement de la plaque inférieure de la chambre d’écoulement en plexiglas.

Positionnez la plaque supérieure en plexiglas sur le dessus du joint et vissez les plaques ensemble. Tournez le robinet à trois voies pour permettre au tampon de lavage PBS-A de s’écouler à travers la vanne. Ensuite, connectez le tube du manomètre à l’orifice d’entrée de la plaque supérieure en plexiglas. Faites passer PBS-A à travers le canal d’écoulement pour permettre aux bulles de passer.

Connectez ensuite le tube du manomètre du pousse-seringue dans l’orifice de sortie de la plaque en plexiglas. Nettoyez tout PBS-A qui a coulé sur la plaque supérieure de la chambre. Enfin, placez la chambre sur la platine d’un microscope à contraste de phase inversé et ajustez la mise au point pour visualiser les cellules endothéliales au-dessus des filtres.

Pour perfuser les leucocytes sur les cellules endothéliales, réglez le tire-seringue pour qu’il se remplisse et appuyez sur Exécuter. Une fois que la mise au point a été ajustée pour visualiser la monocouche de cellules endothéliales, mettez deux millilitres de neutrophiles purifiés dans le réservoir d’échantillon et laissez chauffer pendant deux minutes. Ensuite, lavez l’endothélium avec du PBS-A pendant deux minutes. Ouvrir la valve pour perfuser les neutrophiles sur l’endothélium. Administrez le bolus de neutrophiles pendant quatre minutes. Fermez la vanne et perfuser le PBS-A du réservoir de lavage pour le reste de l’expérience.

Lors de la réalisation de l’expérience, assurez-vous que les bulles d’air ne passent à aucun moment pendant le test, car cela perturberait la monocouche de cellules endothéliales et provoquerait le détachement des neutrophiles adhérents.

Enregistrer le recrutement des neutrophiles pendant l’écoulement des neutrophiles ou en postperfusion à l’aide d’un logiciel de capture d’images numériques. Identifiez le centre du canal en déplaçant l’objectif vers le bord du canal au niveau de l’orifice d’entrée et en identifiant le milieu de l’orifice. Effectuez tous les enregistrements numériques d’au moins 5 à 10 champs au centre du canal d’écoulement.

Pendant l’enregistrement pendant l’écoulement des neutrophiles, prenez des images d’un seul champ toutes les 10 secondes pendant une minute. Déplacez-vous le long du canal et enregistrez une autre trame pendant une minute, en répétant ce processus pendant toute la durée du bolus.

Pour l’enregistrement post-perfusion, faites un enregistrement de 10 secondes de 5 à 10 champs au centre du canal d’écoulement pour évaluer le comportement des leucocytes. Prenez des images toutes les secondes dans l’intervalle de 10 secondes. Cela laisse suffisamment de temps pour la capture à partir de l’écoulement et l’analyse du comportement des neutrophiles adhérents.

Enregistrez une seule trame contenant au moins 10 neutrophiles transmigrés pendant cinq minutes, en prenant des images toutes les 30 secondes. Cela peut être utilisé pour calculer la vitesse des cellules migrées. Enregistrez une autre série de trames de 10 secondes. Cela laisse aux neutrophiles le temps de migrer à travers la monocouche endothéliale.

Enfin, arrêtez le tire-seringue et retirez le tube de sortie, puis le tube d’entrée. Démontez la chambre d’écoulement et rincez le réservoir d’échantillon avec du PBS-A. Répétez l’opération pour les filtres et les canaux de microlames suivants avant de procéder à l’analyse du recrutement et du comportement des leucocytes comme décrit dans le protocole texte.