Quantification par cytométrie en flux de cellules cancéreuses sénescentes induites par la thérapie

Prenez des cellules cancéreuses prétraitées avec un médicament de chimiothérapie qui induit la sénescence dans un pourcentage de cellules.

Ces cellules accumulent des granules de lipofuscine autofluorescents, un marqueur de sénescence connu.

Ajoutez un antibiotique qui pénètre dans les cellules et inhibe les pompes à protons lysosomales, empêchant ainsi l’acidification lysosomale.

Une augmentation du pH inactive les enzymes lysosomales.

Les

cellules sénescentes surexpriment la β-galactosidase lysosomale même à un pH presque neutre, ce qui en fait un biomarqueur de la sénescence.

Introduire un substrat de β-galactosidase. Couver.

β-galactosidase hydrolyse le substrat internalisé en un produit fluorescent, marquant les cellules sénescentes.

Centrifugez et jetez le surnageant.

Ajouter un colorant de viabilité cellulaire. Dans les cellules vivantes, les estérases actives transforment le colorant en un produit fluorescent imperméable à la membrane. Les cellules mortes dont l’intégrité membranaire est compromise ne sont pas colorées.

À l’aide de la cytométrie en flux, détecter les cellules viables présentant les marqueurs doubles lipofuscine et substrat fluorescent de la β-galactosidase,