Un test pour la surveillance en temps réel du pH extracellulaire dans les biofilms dentaires

Prenez une plaque multi-puits contenant une solution salivaire à pH neutre complétée par du glucose.

Ajoutez un colorant proportionnel à double émission, sensible au pH.

Placez la plaque sur une platine de microscope confocal.

Introduisez une plaque de verre avec un biofilm dentaire collé dans le puits vers le bas.

Les bactéries du biofilm fermentent le glucose, générant des acides organiques et abaissant le pH à proximité.

Le pH acide protone le colorant, provoquant son internalisation et sa concentration accrue dans les bactéries, les colorant, tandis que le colorant déprotoné reste extracellulaire.

Au fil du temps, le pH devient acide dans d’autres zones du biofilm.

Lors de l’excitation laser, le colorant protoné présente un décalage de l’émission de fluorescence par rapport à sa forme déprotonée.

Capturez des images fluorescentes à des intervalles spécifiés.

À l’aide d’un logiciel approprié, éliminez les signaux de fluorescence d’origine bactérienne.

Calculer le rapport des intensités d’émission fluorescente de la matrice extracellulaire à deux longueurs d’onde spécifiques, en corrélation avec les valeurs de pH.

Déterminer la diminution du pH du biofilm extracellulaire suite au métabolisme du glucose par les bactéries.

Dans les quelques heures qui suivent le prélèvement du biofilm, après avoir préparé une solution salivaire selon le protocole textuel, titrez la solution à pH 7,0 et ajoutez du glucose à une concentration de 0,4 %. Pipette de 100 microlitres de solution par biofilm à analyser dans une plaque à fond de verre à 96 puits pour la microscopie.

Ajouter 5 microlitres de colorant ratiométrique par puits. Placez la plaque à 96 puits sur la platine du microscope. Ensuite, allumez le microscope et la ligne laser 543. Réchauffez l’incubateur à 37 degrés Celsius. Utilisez les mêmes réglages de microscope que pour l’étalonnage du colorant.

Ensuite, avec une pince à épiler mince, prenez une ou plusieurs plaques de verre et placez-les dans les puits remplis de salive - une dalle par puits avec les biofilms vers le bas. Sous « Contrôle de balayage » → « Unique » pour acquérir des images uniques, ou pour acquérir des piles Z, sous « Contrôle de balayage », « Paramètres Z », « Nombre de tranches », choisissez le nombre de tranches à imager et utilisez « Marquer en premier », « Marquer en dernier » pour marquer la première et la dernière tranche.

Pour suivre les changements de pH dans un champ de vision microscopique au fil du temps, sous « Contrôle de la platine et de la mise au point », « Mark Pos » pour marquer la position XY et prendre des images répétées à des points temporels consécutifs.

Pour exporter les images sous forme de fichiers .tiff, utilisez « Macro » → « File Batch Export » du logiciel du microscope. Marquez les fichiers à exporter et enregistrez les images de canaux rouges et verts dans des dossiers séparés en tant que fichiers .tiff. Ensuite, renommez les fichiers des deux dossiers pour leur donner des numéros séquentiels.

Après avoir importé les séries d’images rouges et vertes dans un logiciel tel que daime, sous « Segmenter » → « Segmentation automatique » → « Seuil personnalisé », segmentez les images de canaux verts avec des seuils de luminosité choisis individuellement. Choisissez le seuil de luminosité avec soin afin que toutes les bactéries, mais pas la matrice, soient reconnues comme des objets lors de la segmentation. Vérifiez visuellement que les zones reconnues comme objets correspondent bien à la biomasse bactérienne.

Il est crucial de sélectionner des seuils de luminosité qui différencient avec précision les cellules de la matrice extracellulaire, et de vérifier visuellement que toutes les cellules bactériennes ont été retirées des images pendant le traitement de l’image.

Sous « Segment » → « Transfert de couche d’objet », transférez la couche d’objet des images de canal vert segmentées vers les images de canal rouge correspondantes. Utilisez la fonction « Éditeur d’objets » pour rejeter et supprimer tous les objets dans les images des canaux rouge et vert, de sorte qu’il ne reste que la matrice extracellulaire dans les images du biofilm.

Ensuite, importez les images d’arrière-plan dans ImageJ et utilisez « Analyser » → « Histogramme » pour déterminer l’intensité moyenne de fluorescence dans les images d’arrière-plan prises avec le laser éteint. Maintenant, importez les images du biofilm dans ImageJ. Sous « Processus » → « Mathématiques » → « Soustraire », soustrayez l’arrière-plan approprié des images rouge et verte. Ensuite, utilisez « Traiter » → « Calculatrice d’image » pour diviser la série d’images vertes G1 par elle-même.

Maintenant, multipliez la série d’images résultante G2 par la série d’images vertes G1. Cela donnera une série d’images G3 où NaN est attribué à tous les pixels appartenant à des zones qui ont été reconnues comme des objets dans daime. Procédez de la même manière avec la série d’images rouges.

Sous « Traiter » → « Filtres » → « Moyenne » ; rayon : un pixel, appliquez le filtre « Moyenne » pour compenser le bruit du détecteur. Ensuite, divisez la série d’images vertes par la série d’images rouges. Il en résulte un rapport vert/rouge pour chaque pixel restant dans l’espace extracellulaire des images.

À partir de « Image » → « Tables de correspondance » utilisent de fausses couleurs pour la représentation graphique des ratios dans les images. Utilisez ensuite « Analyser » → « Histogramme » pour calculer le rapport moyen de chaque image.

Enfin, convertissez les rapports vert-rouge en valeurs de pH selon le protocole texte.