Analyse en temps réel de la migration des lymphocytes T résidents dans différentes régions tumorales à l’aide de la microscopie confocale
JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 vues • 4:23 min • July 8th, 2025
Commencez par une tranche de tumeur pulmonaire contenant des cellules T résidentes.
Les lymphocytes T migrent à travers le microenvironnement tumoral et interagissent avec les cellules tumorales et les éléments stromaux, remplissant ainsi des fonctions immunitaires.
La composition du microenvironnement tumoral influence fortement le déplacement et la vitesse des lymphocytes T.
Ajoutez des anticorps distincts couplés par fluorescence pour marquer les lymphocytes T, les cellules tumorales et les éléments stromaux dans le microenvironnement.
Ajoutez du DAPI, qui infiltre les cellules dont la membrane plasmique est endommagée pour colorer le noyau, permettant ainsi de visualiser les régions nécrotiques de la tumeur.
Observez l’échantillon coloré au microscope confocal.
À l’aide d’une lumière de fluorescence appropriée, sélectionnez une région tumorale d’intérêt contenant des lymphocytes T résidents. Évaluez la viabilité cellulaire en évaluant les cellules DAPI-positives.
Pour une analyse en temps réel, définissez les intervalles de temps et la durée totale d’enregistrement.
Pour capturer des images de la pile z, commencez à une profondeur inférieure aux cellules T étiquetées et capturez des images à différents intervalles de temps.
Utilisez un logiciel de suivi pour comparer la longueur de déplacement des lymphocytes T et la vitesse moyenne dans différentes régions tumorales.
Diluez les anticorps marqués par fluorescence requis et le colorant nucléaire de fluorescence, DAPI, aux concentrations finales requises dans un milieu RPMI sans rouge de phénol. Ensuite, retirez la plaque de culture de l’incubateur et, à l’aide d’une pointe fine, aspirez le liquide à l’intérieur des rondelles en acier inoxydable.
Maintenant, sans toucher la tranche, ajoutez 40 microlitres d’anticorps dilués sur chaque tranche de tumeur. Pour éviter les taches, incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Une fois l’étape de coloration terminée, à l’aide d’une pince fine, retirez les rondelles. Ensuite, sortez délicatement les tranches et trempez-les dans un milieu RPMI1640 sans rouge de phénol pendant 10 secondes. Replacez les tranches sur les inserts de culture cellulaire et ajoutez une goutte de milieu de RPMI1640 sans rouge de phénol sur chaque tranche. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis procéder à l’imagerie.
Plusieurs heures avant de commencer cette expérience, réglez la température de la chambre chauffante du microscope à 37 degrés Celsius, puis préparez le microscope configuré pour perfuser constamment les tranches tumorales avec un milieu RPMI oxygéné sans rouge de phénol, et pour aspirer la solution dans un ballon de collecte des déchets à l’aide d’une pompe péristaltique.
À l’aide d’une pince fine, soulevez la tranche tachée de la plaque à six puits et transférez-la dans un plat en plastique de 35 millimètres rempli d’un milieu RPMI sans rouge de phénol, puis placez une ancre de tranche sur la tranche pour la soutenir. Ensuite, placez cette boîte de Pétri sur la platine d’imagerie du microscope.
Après avoir connecté les embouts d’entrée et de sortie du système de perfusion, allumez la pompe péristaltique pour permettre au fluide oxygéné de passer à travers les tubes de perfusion. Abaissez l’objectif d’immersion dans l’eau sur la tranche et concentrez-vous sur le haut de la tranche avec une lumière en fond clair ou avec la longueur d’onde appropriée.
Ensuite, à l’aide de filtres appropriés, visualisez et sélectionnez une région d’intérêt qui contient toutes les cellules d’intérêt marquées par fluorescence, à savoir les cellules T CD8, les îlots tumoraux et les cellules stromales CD90-positives. Mettre en place une séance d’imagerie en utilisant l’intensité laser et les temps d’exposition adaptés à la luminosité des signaux fluorescents observés. Ensuite, configurez l’épaisseur de la pile Z pour imager la tranche de tumeur.
Ensuite, sélectionnez l’intervalle de temps de l’image Z-stack et la durée totale d’enregistrement pour capturer des images à des intervalles de temps spécifiques. Après avoir capturé et exporté les images fluorescentes, analysez la migration des lymphocytes T CD8 comme décrit dans le protocole texte.
Aperçu
Cette étude examine la dynamique de la migration des lymphocytes T dans des tranches de tumeur pulmonaire, en se concentrant sur leurs interactions avec les cellules tumorales et le microenvironnement environnant. La méthodologie implique un marquage fluorescent et une microscopie confocale afin de visualiser le comportement des lymphocytes T en temps réel.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Immunologie
- Oncologie
- Biologie cellulaire
Contexte
- Les lymphocytes T jouent un rôle crucial dans la réponse immunitaire contre les tumeurs.
- Le microenvironnement tumoral influence fortement le comportement des lymphocytes T.
- La compréhension de la dynamique des lymphocytes T peut éclairer les stratégies d'immunothérapie anticancéreuse.
- L'étiquetage fluorescent permet une observation détaillée des interactions cellulaires.
Objectif de l'étude
- Analyser les schémas de migration des lymphocytes T au sein des tumeurs pulmonaires.
- Évaluer l'impact du microenvironnement tumoral sur le déplacement et la vitesse des lymphocytes T.
- Utiliser des techniques d'imagerie avancées pour une observation en temps réel.
Méthodes utilisées
- Préparation de tranches de tumeur pulmonaire contenant des lymphocytes T résidents.
- Marquage fluorescent des lymphocytes T, des cellules tumorales et des éléments stromaux.
- Microscopie confocale pour l'imagerie et l'analyse de la dynamique cellulaire.
- Logiciel de suivi permettant d'évaluer le déplacement et la vitesse des lymphocytes T.
Résultats principaux
- L'imagerie en temps réel a révélé des profils de migration distincts des lymphocytes T.
- Le microenvironnement tumoral a influencé la vitesse et le déplacement des lymphocytes T.
- Le marquage fluorescent a efficacement mis en évidence les régions nécrotiques et les interactions cellulaires.
- L'analyse des données a permis d'obtenir des informations sur le comportement des lymphocytes T dans différentes régions tumorales.
Conclusions
- L'étude améliore la compréhension de la dynamique des lymphocytes T dans les tumeurs pulmonaires.
- Les résultats pourraient contribuer au développement d'immunothérapies ciblées.
- Les techniques d'imagerie en temps réel sont précieuses pour l'étude des réponses immunitaires dans les tumeurs.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les cadres
L'imagerie confocale en temps réel de la migration des lymphocytes T CD8 résidents dans des tranches de tumeur pulmonaire humaine fournit des informations exploitables sur la dynamique des cellules immunitaires au sein du microenvironnement tumoral. Cette capacité permet une détection mécanistique des risques et une validation ciblée pour les programmes d'immuno-oncologie, renforçant la confiance prédictive à l'interface entre découverte et recherche translationnelle. Des métriques quantitatives de migration orientent les décisions stratégiques en clarifiant l'engagement immunitaire et les obstacles microenvironnementaux.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet l'interrogation directe des interactions entre les lymphocytes T et les cellules tumorales ou le stroma in situ.
- Prend en charge la validation fonctionnelle des cibles en quantifiant le déplacement et la vitesse des cellules immunitaires.
- Apporte une détection mécanistique des risques associés aux cibles immunomodulatrices dans des contextes tissulaires complexes.
- Facilite la confiance prédictive dans les hypothèses sur l'engagement immunitaire.
Développement de tests et criblage
- Établit des systèmes validés de tranches de tumeur ex vivo pour des tests de migration des cellules immunitaires en aval.
- Fournit des résultats reproductibles et quantitatifs sur la motilité des lymphocytes T à travers les régions tumorales.
- Permet la standardisation des protocoles d'imagerie et d'analyse pour le suivi des cellules immunitaires.
- Facilite le criblage de composés ou de produits biologiques modulant la migration des cellules immunitaires.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne les paramètres de migration des cellules immunitaires avec des microenvironnements tumoraux humains pertinents pour la maladie.
- Relie les découvertes à la validation préclinique en préservant l'architecture tissulaire et l'hétérogénéité.
- Guide l'avancement ajusté au risque des actifs en immuno-oncologie selon des lectures fonctionnelles du système immunitaire.
- Prend en charge le développement de biomarqueurs translationnels pour l'infiltration et l'activité des cellules immunitaires.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Ce flux de travail d'imagerie et d'analyse s'intègre dès la phase de découverte jusqu'à la recherche translationnelle, permettant des tests itératifs des hypothèses et une réduction des risques mécanistiques dans les pipelines d'immuno-oncologie.
- Biologie de la découverte : Quantifie la migration des lymphocytes T et leur interaction avec les compartiments tumoraux et stromaux afin de clarifier les voies biologiques.
- Écrantage : Fournit des tests de migration quantitatifs et standardisés pour les modulateurs de cellules immunitaires.
- Analytique : Génère des métriques de déplacement et de vitesse permettant des comparaisons statistiques rigoureuses entre différentes régions tumorales.
- Recherche translationnelle : Préserve le contexte tissulaire humain pour assurer la continuité préclinique et l'alignement des biomarqueurs.
- Réutilisation en entreprise : Offre une plateforme ex vivo réutilisable pour l'étude de la migration des cellules immunitaires dans plusieurs programmes.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Renforce la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans le ciblage des cellules immunitaires.
- Valeur opérationnelle : Fournit des protocoles d'imagerie et d'analyse standardisés et reproductibles pour les études de migration immunitaire.
- Valeur stratégique : Éclaire les décisions de poursuite ou d'abandon et l'affectation des capitaux en clarifiant l'engagement immunitaire dans les tissus tumoraux humains.
- Impact sur le portefeuille : Permet la priorisation ajustée au risque des actifs en immuno-oncologie selon des paramètres immunitaires fonctionnels.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en microscopie confocale et en manipulation de tissus vivants.
- Exige un accès à des plateformes d'imagerie avancées et à des logiciels de suivi.
- Implique une standardisation interéquipes des protocoles de marquage, d'imagerie et d'analyse.
- Une adaptation peut être nécessaire selon les types de tumeurs ou les populations de cellules immunitaires.
- La viabilité et la qualité du tissu peuvent limiter la reproductibilité et l'interprétabilité du test.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
Imagerie animal entier et cytométrie de flux techniques pour T CD8 + Analyse des réponses spécifiques de l'antigène de cellule après nanoparticules vaccination
Vidéos connexes
0 Vues
Utilisation de la technologie MHC seule chaîne d’enquêter sur les Co-agonisme dans l’Activation des cellules T humaines CD8 +
Vidéos connexes
0 Vues
Surveillance en temps réel de la respiration mitochondriale dans les cellules T primaires humaines différenciées par cytokines
Vidéos connexes
0 Vues
Analyse quantitative des migrations au hasard des cellules en utilisant la microscopie vidéo time-lapse
Vidéos connexes
0 Vues
Imagerie des cellules vivantes des cellules exprimant des protéines par fluorescence Migration-étiquetés dans une matrice tridimensionnelle
Vidéos connexes
0 Vues
Imagerie de la migration des cellules tumorales dans le tissu du glioblastome à l’aide de la microscopie confocale à balayage time-lapse
Vidéos connexes
0 Vues
Imagerie en temps réel des cellules myéloïdes Dynamique Apc Min / + Intestinale tumeurs par Spinning Disk microscopie confocale
Vidéos connexes
0 Vues
Analyse de la migration cellulaire dans un tridimensionnelle Matrice Collagène
Vidéos connexes
0 Vues
Un modèle de culture de coupe organotypique du glioblastome humain pour l'étude de la migration des cellules tumorales et des effets spécifiques des patients contre les médicaments anti-invasifs
Vidéos connexes
0 Vues
Ex Vivo Imagerie des Lymphocytes T CD8 résident dans des tumeurs du poumon humain tranches à l’aide de la microscopie confocale
Vidéos connexes
0 Vues
Dernière mise à jour : 29 août 2026