Encyclopédie des expériences JoVE
Immunologie
0 vues • 4:11 min • July 8th, 2025
Prenons une culture cellulaire de mammifère exprimant le domaine répété de la protéine de liaison aux microtubules tau.
Ces rapporteurs tau cytoplasmiques possèdent une mutation sujette à l’agrégation et existent sous forme de monomères.
Les rapporteurs sont fusionnés au fluorophore A ou B, le spectre d’émission du premier chevauchant le spectre d’absorption du second.
Ajoutez un liposome complexé avec des graines de tau ou des agrégats fibrillaires de tau pleine longueur.
En entrant dans la cellule, le liposome libère les graines dans le cytoplasme.
Les graines libérées médient l’agrégation des rapporteurs tau, amenant le fluorophore A près du fluorophore B.
Ajoutez de la trypsine pour détacher les cellules, puis effectuez la fixation.
Analysez les cellules à l’aide d’un cytomètre en flux.
En raison de la proximité au sein de l’agrégat, lors de l’excitation, le transfert d’énergie du fluorophore A à B via une interaction dipôle-dipôle est appelé transfert d’énergie de résonance de fluorescence ou FRET.
Le fluorophore B excité émet un signal FRET, dont la présence indique l’agrégation des protéines.
Pour replaquer les cellules du biocapteur dans des conditions stériles, rincez chaque lignée cellulaire avec du PBS chaud suivi d’une incubation de 3 minutes avec de la trypsine-EDTA. Lorsque les cellules se sont détachées, arrêtez la réaction avec un milieu de culture chaud et transférez immédiatement les cellules dans un tube conique.
Centrifugez les cellules en remettant la pastille en suspension dans un milieu frais. Ensuite, comptez les cellules et faites une dilution de cellules mastermix de 3 500 000 cellules par 13 millilitres de milieu. À l’aide d’une pipette multicanaux, transférez lentement 130 microlitres de cellules dans chaque puits d’une plaque de 96 puits traitée par culture tissulaire à fond plat en prenant soin de placer les pointes de la pipette au centre des puits sans toucher le fond de la plaque.
Une fois que les cellules ont été placées, laissez-les se déposer, sans être dérangées, pendant 10 minutes à température ambiante, puis incubez la plaque pendant la nuit à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone et une humidité relative supérieure ou égale à 80 %. Le lendemain, lorsque les cellules du biocapteur sont confluentes à 60 % à 65 %, combinez un milieu sérique réduit, un réactif liposomique et une source de graines biologiques pour créer des complexes de transduction.
Ensuite, pipetez doucement 20 microlitres de complexe de transduction sur le côté de chaque puits de biocapteur individuel et renvoyez les cellules traitées dans l’incubateur pendant 24 à 48 heures supplémentaires. Avant la récolte, les cellules non traitées ne présenteront qu’une fluorescence diffuse. Cependant, les cellules traitées avec du matériel grainiforme tau montreront des agrégats brillants après 1 à 2 jours.
Pour récolter les cellules, remplacez le milieu de culture cellulaire par 50 microlitres de Trypsine-EDTA, en arrêtant la réaction après 5 minutes avec 150 microlitres de milieu de culture réfrigéré. Transférez immédiatement les cellules sur une plaque à fond rond de 96 puits et granulez les cellules. Aspirez le surnageant sans déranger les granulés, puis remettez doucement mais complètement les cellules en suspension dans 50 microlitres de paraformaldéhyde à 2 % pendant 10 minutes. Ensuite, faites tourner à nouveau les cellules et remettez les granulés en suspension dans 200 microlitres de tampon de cytométrie en flux réfrigéré.