Name: Organotypiques de collagène I Dosage: Une plate-forme malléable pour évaluer le comportement des cellules dans un contexte 3-Dimensional (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Découvrez comment préparer une matrice de collagène tridimensionnelle avec des fibroblastes humains primaires pour étudier la migration cellulaire. Cette méthode reproduit le stroma tissulaire et permet d'analyser l'invasion tumorale par microscopie.

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1. Établissement de cultures de fibroblastes à partir d'explants de peau
<ol>
	<li>Des biopsies prélevées par poinçonnage de 4 mm sur l'avant-bras humain sont placées dans du MEM supplémenté avec 100 unités / ml de pénicilline, 100 μg / ml de streptomycine et 0,25 μg / ml de Fungizone.</li>
	<li>Retirer tout tissu adipeux sous-cutané et hacher finement la biopsie en petits morceaux en faisant osciller une lame de scalpel n°24 contre le fond de la boîte de Pétri.</li>
	<li>Placer la purée tissulaire dans un flacon de culture de 25 cm2 contenant le milieu de croissance pour fibroblastes primaires (MEM supplémenté avec 10 % de FCS, 100 unités / ml de pénicilline, 100 μg / ml de streptomycine et 25 μg / ml de Fungizone), en ajoutant du milieu jusqu'à recouvrir la surface du flacon sans que la profondeur de liquide ne permette au tissu de flotter.</li>
	<li>Après 3 jours d'incubation à 37 °C dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO2, ajouter 3 ml de milieu de croissance pour fibroblastes primaires.</li>
	<li>Après 3 jours supplémentaires d'incubation, remplacer le milieu par du milieu frais pour fibroblastes primaires, ou, si les cellules sont presque confluentes, les repiquer au 1:4 dans du milieu frais. (La Fungizone peut être omise à partir de ce stade).</li>
</ol>
2. Stade I - Préparation de collagène I à partir de queues de rat
Remarque : Protocole pour environ 12 à 14 queues de rats adolescents (fraîches ou congelées)
<ol>
	<li>Préparer la queue de rat en la lavant avec de l'éthanol à 70 % et en retirant les tendons comme suit :</li>
	<li>Enlever la peau de la queue de rat en faisant une incision au milieu de la queue du haut vers le bas à l’aide d’un scalpel, puis en pelant le long de la queue.</li>
	<li>Détacher le tendon du noyau de la région proximale de la queue.</li>
	<li>Retirer le tendon vers la région distale de la queue en évitant la gaine, à l’aide de pinces dentées.</li>
	<li>Extraire 1 g de tendon par 250 ml d’acide acétique 0,5 M en agitant à 4 °C pendant 48 h.</li>
	<li>Centrifuger l’extrait (7 500 × g) pendant 30 min et jeter le culot.</li>
	<li>Ajouter un volume égal de NaCl à 10 % (p/v) au surnageant, et agiter pendant 30 à 60 min.</li>
	<li>Centrifuger (10 000 × g) pendant 30 min, jeter le surnageant, puis redissoudre le précipité dans de l’acide acétique 0,25 M selon un rapport d’environ 1:1, en agitant pendant 24 h à 4 °C.</li>
	<li>Dialyser la solution de collagène contre 6 à 8 changements de 6 L d’acide acétique environ 17,5 mM (1 ml d’acide acétique glacial par litre d’eau froide, changer 2 fois par jour).</li>
	<li>Centrifuger le collagène dialysé à 30 000 × g pendant 1,5 h.</li>
	<li>Retirer le surnageant et le placer dans un flacon stérile.</li>
	<li>Ajuster la concentration en collagène I à environ 2 mg/ml à l’aide d’acide acétique 0,5 mM à 4 °C.</li>
</ol>
3. Stade II - Mise en place de la matrice 3D avec des fibroblastes inclus (laisser rétracter pendant 8 jours).
<ol>
	<li>Assemblez le mélange en utilisant des réactifs froids à 4°C dans un flacon prérefroidi. Garder le collagène I sur glace.</li>
	<li>Pour un flacon T75 flacon de fibroblastes primaires confluentes (˜ nombre de cellules 1 x 106) utilisation :
	<ul>
		<li>25 ml de collagène de queue de rat (concentration d'environ 2 mg/ml)</li>
		<li>3 ml de MEM 10x</li>
		<li>0,22 M NaOH : ajouter d'abord 2 ml, puis ajouter goutte à goutte sous agitation jusqu'à ce que le collagène devienne orange,</li>
		<li>mais pas rose (généralement jusqu'à 3 ml). p environH = 7.2.</li>
		<li>Remarque : Il est important de veiller à ce que le milieu/gel reste neutre ou légèrement acide, car les fibroblastes ne contractent pas le gel lorsqu'ils sont exposés à des conditions même légèrement alcalines.</li>
	</ul>
	</li>
	<li>Traitez les fibroblastes à la trypsine, centrifugez à 400 x g pendant 5 minutes et retirez le surnageant.</li>
	<li>Pendant la centrifugation de 5 min ci-dessus : préparer 12 boîtes plastiques de 35 mm - on obtient normalement 12 boîtes à partir d'un flacon de mélange fibroblastes/collagène.</li>
	<li>Resuspendre les fibroblastes dans 3 ml de SFC et ajouter immédiatement au mélange de collagène en remuant.</li>
	<li>Plaquez environ 2,5 ml de collagène/fibroblastes par boîte aussi rapidement que possible. Essayez d'éviter les bulles et la prise du collagène.</li>
	<li>Laisser le collagène prendre à 37°C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO2 à l'air ambiant pendant 10 min.</li>
	<li>Ajouter 1 ml de milieu de croissance pour fibroblastes (DMEM + 10 % de SFC).</li>
	<li>Détacher la matrice de collagène/fibroblastes des parois de la boîte à l’aide d’une pipette.</li>
	<li>Le lendemain : ajouter 1 ml de milieu de croissance pour fibroblastes (DMEM + 10 % de FCS).</li>
	<li>Changer le milieu tous les deux jours. Laisser le matériau de collage/fibroblastes se contracter pendant environ 8 jours, jusqu'à ce qu'il s'adapte dans une plaque de 24 puits (contraction d'un diamètre d'environ 3,5 cm à 1,5 cm, voir Figure 1).</li>
</ol>
Remarque : la concentration en collagène doit être ajustée en fonction de l'application. Plus la solution de collagène est diluée, plus elle sera contractée rapidement par les fibroblastes. De légères différences de vitesse de contraction seront observées avec différentes lots de collagène à concentration identique. De même, différents cultures de fibroblastes contracteront les gels de collagène à des vitesses différentes, et plus la quantité de fibroblastes est élevée, plus la vitesse de contraction sera rapide. La concentration en collagène et la densité des fibroblastes peuvent donc être ajustées afin de modifier la vitesse de contraction ainsi que la densité finale du gel de collagène.
4. Stade II - Ensemencement des cellules d'intérêt au-dessus de la matrice
Remarque : stériliser toutes les pinces et l'équipement avec de l'éthanol avant utilisation.
<ol>
	<li>À l’aide de pinces contondantes, déplacer délicatement la matrice contractée dans une plaque de 24 puits. Veiller à ce qu’elle ne se replie pas.</li>
	<li>Préparer une suspension de cellules d’intérêt à environ 4 x 104 /ml et ensemencer 1 ml (après trypsination, centrifuger les cellules pour éliminer la trypsine) au-dessus de la matrice. Le nombre exact de cellules nécessaire variera selon le type cellulaire utilisé. Le milieu cellulaire doit être le milieu de croissance normal pour les cellules d’intérêt.</li>
	<li>Laisser les cellules croître jusqu’à confluence au-dessus de la matrice, environ 3 à 5 jours.</li>
</ol>
5. Stade III - Transfert de la matrice vers une grille pour l'invasion (environ 0-21 jours)
<ol>
	<li>Découper des grilles en acier inoxydable pour former un trépied et stériliser par autoclavage avant utilisation (voir Figure 2).</li>
	<li>Placer la grille stérile dans une boîte de 6 cm, ajouter le milieu de croissance jusqu'à un niveau supérieur à celui de la grille (environ 10,5 ml). Placer la matrice sur la grille et aspirer délicatement le milieu afin que le fond de la matrice soit en contact avec le milieu sans être submergé. Ce dispositif est appelé interface air/liquide, qui crée un gradient favorisant l'invasion. Changer le milieu tous les deux jours (voir Figure 2).</li>
	<li>Des images en contexte de cellules vivantes, utilisant des cellules fluorescentes, peuvent être obtenues à ce stade ou précédemment. Le collagène I contracté ou fibrillaire peut être visualisé par génération de seconde harmonique (SHG, voir Figure 3). En utilisant une excitation multiphoton combinée à une détection en champ large, nous observons que la SHG permet d'imaginer jusqu'à au moins 100 μm de profondeur dans la matrice, tandis que les cellules exprimant une GFP cytoplasmique peuvent être imagées à une profondeur d'au moins 200 μm.</li>
</ol>
Remarque : en ce qui concerne la quantification de l'invasion, le jour où les matrices sont placées sur les grilles correspond au jour 0. Le placement sur les grilles crée un gradient de milieu de culture cellulaire qui favorise l'invasion dans la matrice. Les échantillons peuvent être observés au cours des 1 à 21 jours suivants (ou plus) afin d'évaluer des processus biologiques tels que l'invasion, la prolifération, la survie ou la différenciation (voir la liste des références).
6. Stade IV - Fixation
<ol>
	<li>Ajouter 5 ml de PFA à 4 % dans un tube Falcon.</li>
	<li>Transférer la matrice sur une surface plane. Couper la matrice en deux avec un scalpel propre et neuf (car vous allez colorer la section transversale), soulever la matrice avec le scalpel et la transférer dans du PFA à 4 %, puis fixer toute la nuit.</li>
	<li>Les matrices organotypiques sont désormais prêtes à être colorées avec l'anticorps ou le colorant de choix (voir Figure 3).</li>
</ol>
7. Résultats représentatifs :
<img alt="Processus de contraction collagène-fibroblaste ; gel de fibroblastes avec contraction sur 6 à 8 jours, configuration de l'expérience." src="/files/ftp_upload/3089/3089fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1 Exemple de collagène de type I contracté par les fibroblastes. Mélange de fibroblastes et de collagène de queue de rat détaché de la boîte de Pétri et laissé à se contracter pendant 6 à 8 jours.
<img alt="Schéma du test organotypique et configuration de la boîte de Pétri pour l'étude de l'invasion des cellules tumorales et de l'interaction avec les fibroblastes." src="/files/ftp_upload/3089/3089fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2 Progression du test organotypique. A, schéma de la configuration et de la progression du test organotypique. B, Exemple de matrice de collagène/fibroblastes déposée sur une grille stérile en acier inoxydable afin de créer une interface air/liquide.
<img alt="Histologie du carcinome adénocarcinome ductal du pancréas : mutation de P53 par rapport à non invasif ; diagramme d'analyse du collagène." src="/files/ftp_upload/3089/3089fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 3"> 
Figure 3 Applications du test organotypique. A, B cellules non invasives et invasives de carcinome adénocarcinome ductal du pancréas (PDAC) envahissant progressivement la matrice organotypique. C, equivalent cutané vivant montrant un épiderme stratifié sur un composant dermique contracté par des fibroblastes et riche en collagène. D, cellules de mélanome C8161 envahissant un équivalent dermique contracté par des fibroblastes et riche en collagène. E, cellules invasives de PDAC (vert) interagissant et s'insinuant parmi des fibroblastes (rouge) au sein de la matrice organotypique. F, cellules invasives de PDAC (vert) interagissant avec une matrice extracellulaire environnante en cours de dégradation (violet), visualisée à l'aide de la génération de second harmonique basée sur la microscopie multiphoton.

<ol><li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130, 601-610 (2007).</li>
<li>Edward, M., Gillan, C., Micha, D., Tammi, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+regulation+of+fibroblast+hyaluronan+expression%3A+a+mechanism+to+facilitate+tumour+growth+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Tumour regulation of fibroblast hyaluronan expression: a mechanism to facilitate tumour growth and invasion.</a> Carcinogenesis. 26, 1215-1223 (2005).</li>
<li>Patsialou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+human+breast+cancer+cells+in+vivo+requires+both+paracrine+and+autocrine+loops+involving+the+colony-stimulating+factor-1+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Invasion of human breast cancer cells in vivo requires both paracrine and autocrine loops involving the colony-stimulating factor-1 receptor.</a> Cancer Res. 69, 9498-9506 (2009).</li>
<li>Serrels, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+study+of+E-cadherin+and+membrane+dynamics+in+living+animals%3A+implications+for+disease+modeling+and+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time study of E-cadherin and membrane dynamics in living animals: implications for disease modeling and drug development.</a> Cancer Res. 69, 2714-2719 (2009).</li>
<li>Timpson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Regulation+of+RhoA+Activity+during+Pancreatic+Cancer+Cell+Invasion+Driven+by+Mutant+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Spatial Regulation of RhoA Activity during Pancreatic Cancer Cell Invasion Driven by Mutant p53.</a> Cancer Res. 71, 747-757 (2011).</li>
<li>Edward, M., Quinn, J. A., Pasonen-Seppanen, S. M., McCann, B. A., Tammi, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-Methylumbelliferone+inhibits+tumour+cell+growth+and+the+activation+of+stromal+hyaluronan+synthesis+by+melanoma+cell-derived+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">4-Methylumbelliferone inhibits tumour cell growth and the activation of stromal hyaluronan synthesis by melanoma cell-derived factors.</a> Br. J. Dermatol. 162, 1224-1232 (2010).</li>
<li>Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+differentiation+characteristics+of+transformed+keratinocytes+from+mouse+and+human+skin+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Growth and differentiation characteristics of transformed keratinocytes from mouse and human skin in vitro and in vivo.</a> J. Invest. Dermatol. 81, 168s-175s (1983).</li>
<li>Nystrom, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+quantitative+method+to+analyse+tumour+cell+invasion+in+organotypic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture.</a> J. Pathol. 205, 468-475 (2005).</li>
<li>Sabeh, F., Shimizu-Hirota, R., Weiss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protease-dependent+versus+-independent+cancer+cell+invasion+programs%3A+three-dimensional+amoeboid+movement+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protease-dependent versus -independent cancer cell invasion programs: three-dimensional amoeboid movement revisited.</a> J. Cell. Biol. 185, 11-19 (2009).</li>
<li>Amjad, S. B., Carachi, R., Edward, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocyte+regulation+of+TGF-beta+and+connective+tissue+growth+factor+expression%3A+a+role+in+suppression+of+scar+tissue+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regen%22%5BJournal%5D)">Keratinocyte regulation of TGF-beta and connective tissue growth factor expression: a role in suppression of scar tissue formation.</a> Wound Repair Regen. 15, 748-755 (2007).</li>
<li>Gaggioli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast-led+collective+invasion+of+carcinoma+cells+with+differing+roles+for+RhoGTPases+in+leading+and+following+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fibroblast-led collective invasion of carcinoma cells with differing roles for RhoGTPases in leading and following cells.</a> Nat. Cell. Biol. 9, 1392-1400 (2007).</li>
</ol>

Nous n'avons rien à déclarer.

Nous présentons ici une méthode de production d'une matrice tridimensionnelle adaptée à l'étude de la migration cellulaire invasive 6-8. La matrice est constituée de fibrilles de collagène de type 1, qui sont contractées sur une période de plusieurs jours par des fibroblastes épidermiques humains primaires. Le collagène est préparé par extraction acide, et non par digestion enzymatique, ce qui préserve la réactivité des extrémités des peptides et favorise le réticulation des fibrilles de collagène en agrégats plus gros lors de la neutralisation des conditions tampon 9. Cela donne un gel reconstitué qui imite plus fidèlement les caractéristiques du collagène in vivo et a des conséquences importantes sur les propriétés invasives des cellules cultivées dans ces gels. Peu importe que la matière première soit fraîche ou congelée, mais l'utilisation de queues de rats adolescents est essentielle, car le réticulation du collagène est plus labile chez les animaux jeunes. Le collagène I provenant d'animaux jeunes est donc plus facile à extraire et se reconstitue avec une fidélité accrue.
La matrice de collagène peut être fixée et colorée avec des anticorps dirigés contre les cellules tumorales invasives ou les fibroblastes du stroma 2,10 et est très utile pour tester l'efficacité de médicaments susceptibles d'inhiber l'invasion 5,6.
Bien que ce protocole suggère l'utilisation de fibroblastes cutanés humains primaires, il est possible d'utiliser des fibroblastes primaires provenant d'autres types de tissus, selon le type de tissu étudié. Il est également envisageable d'établir des cultures en utilisant des fibroblastes immortalisés, y compris des cellules qui ont été transfectées de manière stable avec des conjugués de protéines fluorescentes. Ainsi, les cellules stromales et tumorales peuvent être marquées afin de visualiser les interactions entre cellules durant l'invasion 11.

<table><tbody><tr><td>MEM 10x</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>21430</td><td>-</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>367176-500G</td><td>Préparer un stock à 0,22 M dans l'eau</td></tr><tr><td>FCS</td><td>PAA Laboratories</td><td>A15-101</td><td>-</td></tr><tr><td>Plaques de 35 mm</td><td>Falcon BD</td><td>353001</td><td>Pour l'étape 3.4</td></tr><tr><td>Plaques de 60 mm</td><td>Falcon BD</td><td>353004</td><td>Pour l'étape 5.2</td></tr><tr><td>Pinces à ressort, émoussées</td><td>Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific</td><td>E003/02</td><td>Dentelées, non lisses</td></tr><tr><td>Parafomaldehyde à 16 %</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>Diluer à 4 % dans du PBS avant utilisation</td></tr><tr><td>Grilles pour cd-1, taille 40 mesh</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S07707-5EA</td><td>Grilles en acier inoxydable, 5 par paquet</td></tr><tr><td>Tubulure de dialyse</td><td>Medicell International</td><td>7607 2295</td><td>12 - 14 kD</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Oxford Labware</td><td>BR0014G</td><td>-</td></tr><tr><td>Acide acétique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242853</td><td>-</td></tr><tr><td>Plaque 24 puits</td><td>Falcon BD</td><td>353047</td><td>Pour l'étape 4.1</td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Invitrogen</td><td>15290018</td><td>-</td></tr></tbody></table>

organotypiques de collagène i dosage: une plate-forme malléable pour évaluer le comportement des cellules dans un contexte 3-dimensional

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

La migration cellulaire est fondamentale pour de nombreux aspects de la biologie, notamment le développement, la cicatrisation des plaies, les réponses cellulaires du système immunitaire et la métastase des cellules tumorales. La migration a été étudiée sur des lamelles en verre afin de rendre les dynamiques cellulaires accessibles à l'analyse par microscopie optique. Toutefois, il est désormais établi que de nombreux aspects de la migration cellulaire dépendent de caractéristiques de l'environnement local, telles que son élasticité, sa composition en protéines et sa taille de pore, qui ne sont pas fidèlement reproduits par des substrats rigides bidimensionnels comme le verre ou le plastique 1. En outre, les interactions avec d'autres types cellulaires, notamment les fibroblastes du stroma 2 et les cellules immunitaires 3, se sont révélées jouer un rôle crucial dans la promotion de l'invasion des cellules cancéreuses. L'analyse au niveau moléculaire a de plus en plus montré que les dynamiques moléculaires, y compris la réponse au traitement médicamenteux, de cellules identiques diffèrent significativement lorsqu'elles sont comparées in vitro et in vivo 4.
Idéalement, il serait préférable d'étudier la migration cellulaire dans son contexte naturel au sein d'organismes vivants, mais cela n'est pas toujours possible. Des systèmes intermédiaires de culture tissulaire, tels que la matrice dérivée de cellules, le matrigel, la culture organotypique (décrite ici), les explants tissulaires, les organoïdes et les xénogreffes, constituent donc des intermédiaires expérimentaux importants. Ces systèmes reproduisent certains aspects d'un environnement in vivo, mais se prêtent mieux aux manipulations expérimentales, comme l'utilisation de lignées cellulaires stablement transfectées, les régimes de traitement par médicaments, ou l'imagerie à long terme et haute résolution. De tels systèmes intermédiaires sont particulièrement utiles comme modèles préliminaires pour valider des sondes et établir les paramètres nécessaires à l'imagerie de la réponse dynamique des cellules et des marqueurs fluorescents, avant d'entreprendre des expériences d'imagerie in vivo 5. En ce sens, ils peuvent jouer un rôle important dans la réduction du recours à des expériences sur des animaux vivants.

Une méthode est décrite pour la préparation d'une matrice tridimensionnelle composée de collagène de type I et de fibroblastes humains primaires. Ce gel organotypique constitue un substrat utile pour évaluer la migration cellulaire invasive, car il imite les caractéristiques fondamentales du stroma tissulaire et se prête à de nombreuses formes de microscopie.

Organotypiques de collagène I Dosage: Une plate-forme malléable pour évaluer le comportement des cellules dans un contexte 3-Dimensional

La migration cellulaire est fondamentale pour de nombreux aspects de la biologie, notamment le développement, la cicatrisation des plaies, les réponses cellulaires du système immunitaire et...

L'objectif général de cette procédure est d'établir une matrice de collagène tridimensionnelle semblable à un tissu afin d'étudier la fonction cellulaire. Cela est réalisé en extrayant d'abord du collagène à partir des tendons de la queue de rat. Ensuite, les fibres de collagène sont reconstituées en présence de fibroblastes, ce qui permet aux fibroblastes de contracter le gel de collagène.Dans la troisième étape, les cellules tumorales sont déposées au sommet de la matrice lors de l'étape finale. La matrice est incubée sur un treillis métallique afin de créer une interface air-liquide permettant l'envahissement des cellules tumorales dans la matrice. Enfin, une coloration immunohistochimique et une microscopie en fluorescence peuvent être réalisées pour analyser la synthèse de la matrice, la migration cellulaire, notamment l'invasion des cellules tumorales, ainsi que les interactions entre différents types cellulaires.Ainsi, cette méthode est idéalement adaptée à l'étude de l'invasion et de la métastase, ainsi qu'au développement tumoral. Sur un substrat tridimensionnel complexe S, nous pouvons examiner des phénomènes tels que la différenciation, la survie cellulaire et la croissance cellulaire. Mais surtout, nous pouvons analyser comment les cellules tumorales interagissent avec le stroma lors d'événements clés de l'invasion.L'une des premières étapes de la métastase cancéreuse consiste à établir des cultures de fibroblastes à partir d'implants cutanés. Déposez d'abord quelques gouttes de MEM supplémenté avec de la pénicilline, de la streptomycine et du fungi zone au fond d'une boîte de Pétri. Ensuite, placez dans la boîte des biopsies obtenues avec un punch de quatre millimètres, prélevées sur l'avant-bras humain.Ensuite, hachez finalement la biopsie en petits morceaux en faisant basculer une lame de scalpel numéro 24 contre le fond de la boîte de Pétri. Placez la suspension tissulaire dans un flacon de culture de tissus de 25 centimètres carrés. Puis versez le milieu de croissance de fibroblastes primaires sur le tissu.Cela suffit pour recouvrir la surface du flacon, mais c'est insuffisant pour permettre au tissu de flotter. Incuber le flacon pendant trois jours à 37 degrés Celsius dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO2, puis ajouter trois millilitres de milieu de croissance primaire pour fibroblastes après encore trois jours d'incubation. Changer le milieu pour du milieu de croissance primaire frais pour fibroblastes.Si les cellules sont presque confluentes, elles peuvent être divisées par quatre dans de nouveaux flacons contenant du milieu frais. Commencez par laver les queues de rat dans de l'éthanol à 70 %, puis refroidissez une bouteille d'acide acétique 0,5 molaire à quatre degrés Celsius afin de retirer les tendons des queues de rat. Retirez d'abord la peau de chaque queue de rat individuelle.Ensuite, détachez le tendon du cœur de la région proximale de la queue. Enfin, retirez le tendon vers la région distale de la queue à l’aide d’une pince dentée. Une fois les tendons retirés, ajoutez 250 millilitres d’acide acétique 0,5 molaire dans un ballon conique en verre.Extraire un gramme de tendon par 250 millilitres d'acide en agitant à quatre degrés Celsius pendant 48 heures après l'extraction du tendon. Centrifuger la solution d'acide et de tendon à 7 500 ×g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius, puis éliminer le culot. Ensuite, ajouter un volume égal de NaCl à 10 % poids par volume au surnageant et agiter pendant 30 à 60 minutes supplémentaires après l'étape de deuxième agitation.Centrifuger la solution. Cette fois à 10 000 ×g, éliminer le surnageant et redissoudre le précipité dans de l'acide acétique 0,25 M avec un nouvel agitation pendant 24 heures à 4 °C. Ensuite, dialyser la solution de collagène contre six à huit changements de six litres d'acide acétique environ 17,5 mM.Après la dialyse, centrifuger le culot de collagène à 30 000 fois G pendant 1,5 heure. Enfin, transférer le surnageant dans un flacon stérile et ajuster la concentration en collagène à environ deux milligrammes par millilitre à l’aide de l’acide acétique 0,5 millimolaire préalablement refroidi, puis conserver le collagène sur de la glace. Premièrement, sélectionner trois flacons T75 de fibroblastes primaires confluentes.Placer un récipient de SFC à quatre degrés Celsius pour le refroidir. Ensuite, ajouter 75 millilitres de collagène de queue de rat préparé précédemment dans un flacon stérile en verre de 100 millilitres prérefroidi. Puis ajouter neuf millilitres de 10 XMEM en remuant le mélange.Ajoutez six millilitres de soude 0,22 normale en ralentissant l'ajout lorsqu'il reste moins d'un millilitre. Veillez à ce que la couleur finale se situe entre l'orange et le rose. Incubez les cellules avec la trypsine, puis centrifugez les fibroblastes à 400 ×g pendant cinq minutes à température ambiante.Pendant la centrifugation, préparez 36 boîtes en plastique de 35 millimètres. Resuspendez le culot dans 10 millilitres de FCS prérefroidi, puis ajoutez immédiatement les fibroblastes au collagène. Mélangez et répartissez environ 2,5 millilitres du mélange collagène-fibroblastes par boîte de 35 millimètres aussi rapidement que possible.Évitez la formation de bulles et la prise du collagène. Placez les boîtes au incubateur pendant 10 minutes pour permettre au collagène de former un gel lâche, puis ajoutez un millilitre de milieu de croissance des fibroblastes dans chaque boîte. Ensuite, détachez la matrice de collagène des fibroblastes des bords de la boîte à l’aide d’une pipette et remettez les boîtes dans l’incubateur.Le jour suivant, ajoutez un autre millilitre de milieu de croissance Fiberblast dans les boîtes. Ensuite, changez le milieu tous les deux jours pendant environ huit jours. Pendant cette période, chaque matrice de fibroblastes au collagène doit se contracter d'environ 3,5 centimètres à environ 1,5 centimètre de diamètre. Avant de commencer l'étape suivante, stérilisez toutes les pinces et l'équipement avec de l'éthanol.Ensuite, à l’aide de pinces stériles à extrémités émoussées, déplacer délicatement une matrice contractée dans un puits d’une plaque de 24 puits, en veillant à ce que la matrice ne se replie pas. Puis, sélectionner un flacon de cellules à étudier, détacher les cellules à l’aide de lames de trituration et centrifuger les cellules comme précédemment, puis resuspendre les cellules dans le milieu, déposer un millilitre de la suspension cellulaire au-dessus de la matrice, et placer la matrice contractée dans l’incubateur jusqu’à ce que les cellules aient presque atteint la confluence en surface de la matrice. Environ trois à cinq jours après la stérilisation par autoclavage, préparer des grilles en acier inoxydable découpées pour la fabrication de trépieds avant utilisation : placer une grille stérile dans une boîte en plastique de six centimètres et ajouter suffisamment de milieu de croissance pour recouvrir la grille.La création de l'interface air-liquide est la partie la plus délicate de cette procédure. La matrice doit être placée sur la grille, puis le milieu doit être aspiré délicatement de manière à ce que la matrice reste partiellement immergée par le bas et soit alimentée par le bas. Cela crée un gradient chimiotactique et permet aux cellules situées en surface de commencer à envahir la matrice.Le comportement cellulaire dans ce dispositif peut ensuite être évalué sur une période de 21 jours ou plus. Placer une matrice sur la grille. Ensuite, aspirer délicatement le milieu jusqu'à ce que le fond de la matrice soit en contact avec le milieu, sans en être recouvert.L'interface air-liquide doit alors ressembler à la scène illustrée ici. Ensuite, transférez une matrice infiltrée sur une surface plane. Coupez la matrice en deux à l’aide d’un scalpel neuf, puis soulevez-la avec le scalpel et transférez-la dans du PFA à 4 %.Fixez la matrice toute la nuit à température ambiante. Dans les deux figures suivantes, des cellules de carcinome adénocarcinomateux ductal pancréatique, ou cellules P DAC, ont été déposées sur une matrice organotypique. Dans la première figure, des cellules P dac non invasives sont visibles en couche au-dessus de la matrice, tandis que dans cette seconde figure, des cellules P dac invasives ayant infiltré la matrice sont observées. On peut voir ici un équivalent cutané vivant montrant un épiderme stratifié sur un composant dermique collagénique contracté par des fibroblastes. Des cellules PD invasives en vert sont visibles interagissant avec des fibroblastes en rouge, qui favorisent l'envahissement des cellules PDX par la matrice organotypique.Les cellules PD invasives montrées ici en vert sont à nouveau visualisées au sein de la matrice de collagène, qui est imagée par génération de deuxième harmonique et représentée en violet ; les sites de dégradation de la matrice apparaissent comme des trous sombres au sein de la matrice violette. Sur cette figure, des cellules de mélanome C 8 1 61 envahissant un équivalent dermique riche en collagène contracté par des fibroblastes sont illustrées. En plus de l'analyse du comportement de processus fondamentaux des protéines fluorescentes durant cet essai, vous pouvez également utiliser cet essai conjointement à une coloration immunohistochimique pour examiner des marqueurs de prolifération cellulaire ainsi que des différences dans la survie cellulaire, entre autres.

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