Une procédure de pointe STAGE pour le dessalage et la purification des peptides

Prenez une STop And Go Extraction ou STAGE Tip, une colonne de purification miniaturisée.

L’embout contient de petites billes de silice liées à de longues chaînes d’hydrocarbures pour la purification peptidique basée sur l’interaction hydrophobe.

Laver avec des tampons contenant un pourcentage élevé d’acétonitrile, en éliminant les impuretés de la résine.

Introduisez un tampon de liaison et une centrifugeuse, équilibrant la colonne pour une liaison optimale des peptides.

Chargez un échantillon peptidique prédigéré obtenu à partir de cellules différenciées de type neutrophile, contenant des fragments de peptides et des impuretés, y compris des sels.

Centrifugeuse pour faire passer l’échantillon à travers la colonne. Les fragments peptidiques se lient aux chaînes d’hydrocarbures par des interactions hydrophobes, tandis que les sels sont éliminés.

Ajoutez le tampon de liaison et centrifugez, en éliminant les impuretés restantes.

Introduire le tampon à haute teneur en acétonitrile pour l’élution.

À l’aide d’une seringue, faites passer le tampon dans la colonne. L’acétonitrile se lie aux chaînes d’hydrocarbures, déplaçant les fragments de peptides qui s’éluent avec le tampon.

Effectuer un profilage protéomique pour identifier les peptides purifiés.

Pour commencer, emballez trois couches de résine C18 dans une pointe de pipette de 200 microlitres pour construire une pointe STop And Go Extraction ou STAGE pour chaque échantillon de peptide.

Arrêtez la digestion enzymatique des échantillons de peptides précédemment incubés en ajoutant 1 par 10 volumes de solution d’arrêt. Centrifugez les échantillons à 13 200 tr/min pendant 10 minutes et transférez le surnageant dans un nouveau tube de 2 millilitres.

Ensuite, lavez les embouts STAGE avec 100 microlitres d’acétonitrile à 100 % et centrifugez les embouts STAGE à 1000 g pendant 2 minutes ou jusqu’à ce que tout le liquide passe à travers la résine C18.

Répétez les lavages à la pointe STAGE avec 50 microlitres de tampon B suivis de 200 microlitres de tampon A avec les mêmes conditions de centrifugation.

Chargez les échantillons dans les pointes STAGE pour les centrifuger à 1000 g pendant 3 à 5 minutes. Ensuite, laver les pointes STAGE avec 200 microlitres de tampon A par centrifugation à 1000 g pendant 3 à 5 minutes.

Ensuite, ajoutez 50 microlitres de tampon B dans chaque embout STAGE et, à l’aide d’une seringue, éluez les échantillons contenant le tampon B dans un tube PCR de 0,2 millilitre.

Une fois les échantillons élués, séchez les peptides à l’aide d’une centrifugeuse sous vide pendant 45 minutes. Analysez les échantillons sur la spectrométrie de masse à haute résolution dans les conditions décrites dans le manuscrit.

Pour traiter les données pour le profilage protéomique, téléchargez les fichiers de données brutes obtenus par spectrométrie de masse dans le logiciel MaxQuant. Reportez-vous au manuscrit du texte pour tous les paramètres du logiciel et ses réglages.

Dans les paramètres globaux, importez le fichier FASTA d’Homo sapiens pour l’identification des séquences téléchargées à partir de la base de données Uniprot en enregistrant l’ID de l’organisme, le nombre de protéines et la date de téléchargement du fichier.

Définissez le nombre de cœurs d’ordinateur pour le traitement et sélectionnez Démarrer. Une fois MaxQuant terminé, un dossier « Combined », ainsi que d’autres fichiers nécessaires au téléchargement dans des référentiels de données, sont générés.

Pour analyser les données, téléchargez le proteingroups.txt dans Perseus et sélectionnez tous les fichiers de quantification sans étiquette ou d’intensité LFQ dans la fenêtre « Principale ». Filtrez les rangées en supprimant les contaminants, les peptides inverses et les peptides identifiés uniquement par site et transformez les données par log₂(x).

Pour observer le nombre de protéines détectées dans chaque répétition, construisez un diagramme de Venn numérique et définissez des annotations catégorielles pour chaque échantillon en fournissant le même nom pour toutes les répétitions d’un échantillon biologique.

Filtrez les lignes en fonction de la valeur valide, la protéine étant identifiée dans plus de 50 % des répétitions et au sein d’au moins un groupe. Pour remplacer les valeurs manquantes pour LFQ, effectuez l’imputation à partir de la distribution normale.

Ajoutez des informations d’annotation téléchargées depuis le site Web de Perseus aux rangées de protéines en ajoutant txt.gz fichiers FASTA dans les dossiers 'bin', 'conf' et 'annotation'. Apportez des termes spécifiques tels que les noms de protéines, les noms de gènes et l’ontologie génétique.

La matrice est maintenant complète et peut être visualisée dans des outils tels que les graphiques d’analyse en composantes principales, les cartes thermiques et l’enrichissement des catégories. Effectuer des tests statistiques pour déterminer les changements significatifs dans l’abondance des protéines entre les conditions testées.