Évaluation des anticorps neutralisants fonctionnels du SRAS-CoV-2

Commencez par du sérum humain dilué en série contenant des concentrations variables d’anticorps neutralisants contre le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère ou le SRAS-CoV-2.

Introduire des virus pseudotypés avec l’ARN luciférase, l’intégrase et la transcriptase inverse, encapsulés dans une bicouche lipidique contenant les protéines de pointe du SRAS-CoV-2.

Les anticorps neutralisent les virus en fonction de la dilution sérique, les dilutions inférieures présentant une neutralisation maximale.

Introduire des cellules cibles exprimant les récepteurs de l’enzyme de conversion de l’angiotensine-2 ou les récepteurs ACE2 et la protéase transmembranaire sérine-2 ou TMPRSS2.

Dans des dilutions sériques plus élevées, les virus non neutralisés interagissent avec les récepteurs ACE2, tandis que TMPRSS2 clive la protéine de pointe, permettant la fusion des virus.

À l’entrée, l’ARN de la luciférase est transcrit en ADN qui s’intègre dans le génome de l’hôte et produit l’enzyme luciférase.

Remplacez le milieu par un tampon d’essai contenant un substrat de luciférase et un agent de lyse.

Les cellules se lysent, libérant de la luciférase intracellulaire, qui interagit avec le substrat et produit une luminescence élevée.

Quantifiez la luminescence à travers les dilutions sériques pour déterminer le pourcentage de neutralisation virale - la dilution atteignant une neutralisation de cinquante pour cent représente le titre de neutralisation.

Pour commencer, ajoutez 50 microlitres de DMEM avec 10 pour cent de FBS et 1 pour cent de pénicilline-streptomycine aux rangées B à H, colonnes 1 à 12 d’une plaque blanche à 96 puits.

Ajouter 5 microlitres de sérum de convalescent dans les puits de la rangée A, colonnes 2 à 10, pour un volume total de 100 microlitres de DMEM avec 10 pour cent de FBS et 1 pour cent de pénicilline-streptomycine. Ajouter 5 microlitres d’antisérums positifs et négatifs dans les puits A11 et A12 comme témoins.

Retirez 50 microlitres de la solution des puits de la rangée A et effectuez des dilutions en série de tous les puits situés en dessous. Pour chaque dilution, utilisez une pipette multicanaux pour mélanger les solutions 5 à 10 fois en pipetant de haut en bas sans créer de bulles d’air.

Une fois la dilution en série terminée, jetez les 50 microlitres restants du dernier puits de chaque colonne.

Centrifugez la plaque pendant 1 minute à 500 rotations par minute pour vous assurer qu’il ne reste aucun liquide sur les parois du puits. Calculez la quantité de DMEM nécessaire pour diluer la PV du SRAS-CoV-2 comme décrit dans le manuscrit

Mélangez la solution photovoltaïque diluée dans un bassin de pipette et aliquotez 50 microlitres dans chaque puits, à l’exception des puits A6 à A12 qui comprennent le contrôle à pile uniquement. Les puits A1 à A6 servent de contrôle PV uniquement.

Centrifugez la plaque pendant 1 minute à 500 rotations par minute pour vous assurer qu’aucun virus ne reste sur les parois du puits. Ensuite, incubez les plaques à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 1 heure pour permettre au sérum de se lier à la glycoprotéine du SRAS-CoV-2.

Ensuite, préparez une plaque de cellules cibles HEK 293T/17 transfectées 24 heures plus tôt avec des plasmides ACE2 et TMPRSS2. Retirez le milieu de culture de la plaque et lavez-le deux fois avec 2 millilitres de PBS, en l’ajoutant sur un côté de la boîte pour éviter le détachement des cellules.

Jeter le PBS et ajouter 2 millilitres de trypsine dans la plaque. Placez la plaque dans un incubateur jusqu’à ce que les cellules se détachent.

Une fois que les cellules se sont détachées, ajoutez 6 millilitres de DMEM avec 10 pour cent de FBS et 1 pour cent de pénicilline-streptomycine dans la plaque pour éteindre l’activité de la trypsine et remettre les cellules en suspension doucement.

Comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé ou en comptant la lame de la chambre. Ajoutez 1 x 10⁴ cellules aliquotes dans un volume total de 50 microlitres dans chaque puits et incubez la plaque à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 48 à 72 heures.

Après l’incubation, retirer le milieu de culture de tous les puits et ajouter 25 microlitres d’un mélange 1:1 de PBS et d’un réactif commercial de dosage de la luciférase. Lire la plaque à l’aide d’un système commercial de dosage de la luciférase avec un luminomètre sur microplaques.

À l’aide des données brutes générées par le luminomètre, calculez les titres d’anticorps neutralisants IC50 comme décrit dans le manuscrit du texte.