Isolement de lymphocytes T tueurs naturels invariants à partir d’un modèle murin
JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 vues • 3:35 min • July 8th, 2025
Commencez par injecter par voie intrapéritonéale un glycolipide synthétique dans une souris.
Les cellules présentatrices d’antigènes, ou APC, internalisent le glycolipide et le présentent via la molécule non classique du CMH CD1d.
Les APC migrent vers la rate et interagissent avec les lymphocytes T tueurs naturels invariants ou cellules iNKT, induisant l’activation et la prolifération des cellules iNKT.
Récoltez la rate. Dissociez-le mécaniquement pour générer une suspension unicellulaire.
Transférez les cellules dans un tube. Ajouter un milieu à gradient de densité et centrifuger pour séparer les lymphocytes.
Prélever les lymphocytes. Ajoutez des tétramères CD1d marqués au fluorophore chargés d’antigènes glycolipidiques qui interagissent avec les cellules iNKT.
Retirer les tétramères non liés. Recouvrir de microbilles magnétiques qui se lient aux fluorophores liés au tétramère.
Retirez les billes déliées et chargez la suspension de la cellule sur une colonne magnétique.
Sous le champ magnétique, les cellules iNKT liées à des billes sont retenues dans la colonne tandis que les cellules restantes s’écoulent.
Retirez la colonne du champ magnétique. Ajouter un tampon d’élution pour éluer les cellules iNKT.
Injecter par voie intrapéritonéale de la souris DBA/1 normale avec alpha-GalCer, à la dose de 0,1 milligramme par kilogramme de poids corporel. Trois jours après la modélisation, après anesthésie, isolez la rate de la souris. Préparez une suspension unicellulaire en coupant et en broyant la rate dans un tamis de 200 mailles. Lavez la suspension cellulaire avec du PBS. Centrifugez à 200 fois g pendant 5 minutes et jetez le surnageant.
Remettez les cellules en suspension avec 1 millilitre de solution de dilution de sang total et de tissus. Ajouter 3 millilitres de milieu de séparation des lymphocytes de souris, puis centrifuger les cellules pendant 20 minutes, à 300 fois g, à température ambiante.
Pour purifier les cellules iNKT, remettez en suspension 10 à 7 cellules avec 100 microlitres de PBS à 4 degrés Celsius. Ajoutez 10 microlitres de CD1d Tetramer-PE chargé d’alpha-GalCer et incubez-les à 4 degrés Celsius pendant 15 minutes dans l’obscurité. Lavez les cellules deux fois avec du PBS et mettez-les en suspension dans 80 microlitres de PBS. Ajoutez 20 microlitres de microbilles anti-PE et incubez-les à 4 degrés Celsius pendant 20 minutes dans l’obscurité. Lavez-les deux fois avec du PBS et remettez en suspension les cellules avec 500 microlitres de PBS.
Placez la colonne de tri dans le champ magnétique du trieur MACS, et rincez avec 500 microlitres de PBS. Ajoutez la suspension cellulaire préparée dans la colonne de tri, collectez le flux et rincez trois fois avec un tampon PBS. Retirez le champ magnétique et ajoutez 1 millilitre de tampon PBS à la colonne de tri. Poussez rapidement le piston à une pression constante pour enfoncer les cellules marquées dans le tube de collecte et obtenez les cellules iNKT purifiées. Comptez avec un compteur de cellules automatisé.
Aperçu
Cet article décrit une méthode permettant d'isoler des cellules T natural killer invariables (iNKT) à partir de tissu splénique de souris. Le processus implique l'utilisation d'un glycolipide synthétique et de techniques d'étiquetage spécifiques pour purifier les cellules iNKT en vue d'études ultérieures.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Immunologie
- Biologie cellulaire
- Neurosciences
Contexte
- Les cellules T natural killer invariables (iNKT) jouent un rôle crucial dans les réponses immunitaires.
- Comprendre l'activation des cellules iNKT peut fournir des informations sur la régulation immunitaire.
- L'isolement des cellules iNKT est essentiel pour étudier leurs fonctions et leurs mécanismes.
- L'utilisation de glycolipides comme antigènes est une méthode courante pour l'activation des cellules iNKT.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode fiable pour isoler les cellules iNKT à partir de la rate de souris.
- Faciliter l'étude de la biologie des cellules iNKT et de leur rôle dans les réponses immunitaires.
- Fournir un protocole pouvant être reproduit dans d'autres contextes de recherche.
Méthodes utilisées
- Injection intrapéritonéale de glycolipide synthétique chez des souris.
- Isolation de la rate et préparation d'une suspension monocellulaire.
- Utilisation d'une centrifugation en gradient de densité pour séparer les lymphocytes.
- Application de tétramères CD1d et tri magnétique pour purifier les cellules iNKT.
Résultats principaux
- Isolation réussie des cellules iNKT à l'aide du protocole décrit.
- Pureté élevée des cellules iNKT obtenue par tri magnétique.
- Démonstration de l'efficacité des antigènes glycolipidiques pour activer les cellules iNKT.
- Le protocole peut être adapté à divers besoins expérimentaux.
Conclusions
- La méthode fournit une approche robuste pour isoler les cellules iNKT.
- Les connaissances acquises peuvent améliorer la compréhension des mécanismes immunitaires.
- De futures études pourront s'appuyer sur ce protocole afin d'explorer les fonctions des cellules iNKT.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les cadres
L'isolement fiable des cellules T natural killer invariables (iNKT) à partir de modèles murins permet une interrogation précise de la fonction des cellules immunitaires et soutient une détection mécanistique des risques dans les programmes de découverte centrés sur l'immunologie. Cette capacité est essentielle pour la validation des cibles et pour l'établissement de modèles précliniques robustes qui orientent la recherche translationnelle. Des préparations de cellules iNKT de haute pureté facilitent des tests en aval reproductibles, renforçant ainsi la fiabilité prédictive des stratégies de modulation immunitaire.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet de tester directement des hypothèses immunologiques impliquant l'activation et la fonction des cellules iNKT.
- Permet une détection mécanistique des risques en isolant des populations cellulaires pour l'analyse des voies.
- Facilite la validation fonctionnelle de cibles dans des contextes immunitaires pertinents pour la maladie.
Développement de criblages et de tests
- Fournit des cellules iNKT normalisées et de haute pureté pour le développement de tests et le criblage de composés.
- Améliore la reproductibilité et la précision quantitative des tests basés sur les cellules immunitaires.
- Permet une préparation évolutive de populations cellulaires validées pour une réutilisation sur plateforme.
Recherche translationnelle et préclinique
- Permet le développement de modèles précliniques pour les études de modulation immunitaire.
- S'inscrit dans les stratégies translationnelles de biomarqueurs en permettant des lectures fonctionnelles à partir de cellules iNKT isolées.
- Réduit l'ambiguïté biologique dans les programmes thérapeutiques ciblant le système immunitaire.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Ce protocole d'isolement des cellules iNKT s'inscrit dans la continuité entre la découverte précoce et le stade préclinique, soutenant à la fois la recherche fondée sur des hypothèses et le développement de tests pour les programmes de modulation immunitaire.
- Biologie de la découverte : Permet l'isolement et le test fonctionnel des cellules iNKT pour la validation de voies et de cibles.
- Criblage : Fournit des entrées reproductibles et quantitatives pour des tests cellulaires destinés à l'évaluation de composés.
- Analytique : Produit des résultats mesurables tels que les nombres cellulaires et la pureté, permettant des comparaisons entre différentes conditions.
- Recherche translationnelle : Fait le lien entre la découverte et les études précliniques en fournissant des populations de cellules immunitaires pertinentes pour la maladie.
- Réutilisation en entreprise : Établit un flux de travail standardisé adaptable à l'ensemble des programmes de recherche sur les cellules immunitaires.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la validation des cibles immunitaires.
- Valeur opérationnelle : Fournit une isolation cellulaire standardisée, reproductible et évolutive pour les flux de travail en aval.
- Valeur stratégique : Améliore la qualité des décisions de poursuite ou d'abandon et l'efficacité du capital dans les portefeuilles axés sur l'immunité.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des actifs de modulation immunitaire.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en immunologie et en techniques d'isolement cellulaire.
- Suppose l'accès à la cytométrie en flux, au tri magnétique et aux instruments de comptage cellulaire.
- Exige une standardisation interéquipes pour assurer la reproductibilité et la comparabilité des données.
- Adaptable à divers modèles murins, mais peut nécessiter une optimisation du protocole selon les souches.
- Dépend de la disponibilité de réactifs spécifiques tels que les antigènes glycolipidiques et les tétramères marqués.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
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Dernière mise à jour : 22 août 2026