Transfection de macrophages primaires avec de l’ARNm modifié

Commencez avec un tube contenant des ARNm transcrits in vitro qui codent pour des protéines fluorescentes vertes.

L’ARNm contient des nucléotides modifiés, la 5-méthyl-cytidine triphosphate et la pseudouridine triphosphate, qui empêchent la réponse immunitaire et améliorent la stabilité de l’ARNm.

L’extrémité 5' de l’ARNm est déphosphorylée, ce qui empêche sa reconnaissance par les récepteurs de reconnaissance de motifs sur les macrophages.

Ajoutez un réactif de transfection à base de lipides cationiques à l’ARNm, facilitant l’encapsulation de l’ARNm par des interactions électrostatiques et formant un complexe.

Introduisez les complexes lipides-ARNm dans une plaque multipuits avec des macrophages primaires dérivés de souris collés et agitez doucement pour un mélange uniforme.

Les macrophages internalisent le complexe contenant l’ARNm dans un endosome. Plus tard, le complexe fusionne avec la membrane endosomale, libérant les ARNm dans le cytoplasme cellulaire.

La queue poly-A à l’extrémité 3' stabilise l’ARNm qui subit la synthèse des protéines pour produire des protéines fluorescentes vertes.

Au microscope à fluorescence, la fluorescence verte à l’intérieur des macrophages suggère