Encyclopédie des expériences JoVE
Immunologie
0 vues • 5:23 min • July 8th, 2025
Commencez par les cellules sanguines de cordon ombilical humain, y compris les cellules souches hématopoïétiques CD34+, ou CSH.
Ajoutez des anticorps pour bloquer les récepteurs cellulaires Fc, empêchant ainsi la liaison non spécifique des billes magnétiques spécifiques aux CSH.
Introduisez les billes magnétiques enrobées d’anticorps ciblant les CSH CD34+. Centrifugez et jetez le surnageant.
Remettez les cellules en suspension dans une mémoire tampon. Passez-les à travers un séparateur magnétique pour retenir les HSC liés aux billes ; les cellules non liées s’écoulent à travers.
Supprimez le champ magnétique pour collecter les HSC.
Centrifugez et mettez les cellules en suspension dans un milieu de croissance. Plaquez les cellules et incuberez.
Le milieu contient des facteurs de croissance et des cytokines qui favorisent la survie et l’expansion des CSH.
Récoltez les cellules. Ajouter un fluide de congélation, transférer dans un flacon cryogénique et congeler.
Pour générer un modèle murin du système immunitaire humain, ou SIH, décongelez les CSH. Ajoutez-les à un milieu préchauffé.
Centrifugez et remettez les cellules en suspension dans un tampon.
Les cellules sont prêtes à être injectées dans un bébé souris immunodéficient pour la génération de modèles HIS.
Pour commencer, réintroduisez la pastille de cellules CD34-positive isolée du sang de cordon dans 300 microlitres de tampon séparateur de cellules magnétiques pour 1 x 108 cellules. Ajouter 100 microlitres de réactif bloquant FcR par 1 x 108 cellules, suivis de 100 microlitres de billes magnétiques CD34 positives pour 1 x 108 cellules, et incuber à 4 degrés Celsius pendant 30 minutes.
Ensuite, ajoutez 5 millilitres de tampon de séparation de cellules magnétiques pour 1 x 108 cellules et faites tourner à 360 g pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius. Répétez l’étape de lavage et remettez en suspension la pastille dans 500 microlitres par 100 millions de cellules de tampon séparateur de cellules magnétiques dans un tube conique de 15 millilitres étiqueté « non fractionné ». Étiquetez deux autres tubes de 15 millilitres : CD34 négatif et CD34 positif. Placez les trois tubes sur une grille de refroidissement.
Séparez les cellules à l’aide du programme de sélection positive à deux colonnes sur un séparateur de cellules magnétique automatique dans une enceinte de biosécurité. Ensuite, pour l’expansion et la congélation de cellules souches humaines CD34 positives, préparez du sang de cordon ombilical ou un milieu CB comme décrit dans le manuscrit et passez-le à travers un filtre de 0,22 micron. Remettez en suspension les cellules CD34 positives à 100 000 par millilitre de milieu CB et incubez à 37 degrés Celsius.
Le troisième jour, ajoutez un volume égal de milieu CB sans cytokines dans le flacon. Le cinquième jour, récoltez les cellules CD34 positives élargies. Pipetez la suspension cellulaire de haut en bas et collectez dans un tube conique de 50 millilitres. Ajouter suffisamment de milieu CB pour couvrir le fond de la fiole. À l’aide d’un grattoir à cellules, racler tout le fond de la fiole. Rassemblez tous les fluides dans le même tube de 50 millilitres et centrifugez.
Remettez les cellules en suspension dans 2 millilitres de milieu CB et centrifugez. Aspirez le fluide jusqu’au granulé et remettez le granulé en suspension dans un milieu de congélation. Ensuite, commencez la préparation des cellules CD34 positives trois heures après l’irradiation des petits. Réchauffez 10 millilitres de média CB dans un tube de 50 millilitres.
Récupérer un flacon de cellules CD34 positives expansées et congelées in vitro pour quatre à six petits à injecter. Décongelez rapidement à 50 à 55 degrés Celsius, jusqu’à ce qu’une petite quantité de glace soit visible, et ajoutez les cellules au milieu CB réchauffé. Utilisez 1 millilitre de fluide pour rincer chaque flacon et faites tourner les cellules à 360 g pendant 12 minutes à 4 degrés Celsius.
Aspirez le fluide avec précaution. Remettez la pastille en suspension dans 2 millilitres de milieu CB et comptez les cellules. Encore une fois, centrifugez les cellules, aspirez le milieu et remettez la pastille en suspension dans 100 microlitres de PBS stérile par n plus 1 chiot à injecter, ce qui donne 250 000 à 450 000 cellules CD34 positives par souris.