Encyclopédie des expériences JoVE
Immunologie
0 vues • 3:44 min • July 8th, 2025
Prenez deux cuvettes d’électroporation. Une cuvette contient un petit ARN interférent, ou siRNA, conçu pour inhiber la production de FIP200, une protéine induisant l’autophagie.
La deuxième cuvette contient un siRNA brouillé comme contrôle qui n’inhibe pas la production de FIP200.
Ajoutez des cellules dendritiques immatures, ou iDCs ; électroporate pour l’entrée cellulaire de siRNA, puis plaquez les cellules.
Le siRNA internalisé se lie à un complexe de silençage induisant l’ARN.
Le complexe avec le siRNA spécifique de FIP200 clive son ARNm cible, inhibant la production de FIP200, tandis que les iDC de contrôle traités par siRNA produisent FIP200.
Récoltez les cellules et ajoutez-y le virus de l’herpès simplex. Lors de la fusion de l’enveloppe virale et de la membrane cellulaire, l’ADN libéré pénètre dans le noyau et conduit à la production de protéines virales et de nucléocapsides.
Les protéines virales perturbent les lamines nucléaires. FIP200 forme un complexe qui déclenche une cascade de signalisation, induisant l’autophagie des lamines perturbées pour les cibler pour la dégradation et facilitant l’échappement des nucléocapsides virales dans le cytoplasme.
L’inhibition de la production de FIP200 par l’ARNi limite l’autophagie de la lamine, empêchant ainsi la fuite de la nucléocapside.
Les cellules sont prêtes à évaluer l’inhibition de l’autophagie induite par les siRNA.
Au 3,5e jour après l’observance, transférez 12 millions d’iDC dans un tube de 50 millilitres. Centrifugez-les à 300 fois g pendant 5 minutes, puis jetez le surnageant. En parallèle, effectuer une analyse cytométrique en flux pour surveiller l’état de maturation.
Lavez délicatement les iDC dans 5 millilitres d’OptiMEM sans rouge de phénol, et centrifugez-les à 300 fois g pendant 5 minutes. Jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 200 microlitres d’OptiMEM, en ajustant la concentration cellulaire à 6 millions de cellules par 100 microlitres.
Ajoutez 75 picamoles de siRNA spécifiques à FIP200 ou brouillés dans des cuvettes d’électrodes de 4 millimètres et transférez 100 microlitres de suspension cellulaire dans la cuvette respective. Pulsez directement les iDC à l’aide d’un appareil d’électroporation.
Après électroporation, transférez les iDC dans des plaques à six puits avec un milieu DC frais préchauffé, en ensemencant les cellules à une concentration finale de 1 million de cellules par millilitre, et placez-les dans l’incubateur. Après 48 heures, examinez la morphologie des iDC électroporés au microscope, puis récoltez les cellules à l’aide d’un grattoir cellulaire et transférez-les dans des tubes de 15 millilitres.
Rincez les puits avec 1 millilitre de PBS complété par 0,01 % d’EDTA et transférez la solution dans les tubes respectifs. Ensuite, divisez les cellules pour chaque condition de siRNA comme décrit dans le manuscrit.
Utilisez 500 000 cellules pour évaluer l’état de maturation et la viabilité cellulaire. Utilisez 1 million de cellules pour l’analyse par transfert Western afin de vérifier l’efficacité spécifique de 200 knockdown, et utilisez les cellules restantes pour les expériences d’infection par le HSV-1.