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Immunologie
0 vues • 4:42 min • July 8th, 2025
Prenez des vecteurs rétroviraux mélangés à des cellules primaires de la rate.
Les vecteurs contiennent de l’ARN transgénique codant pour un récepteur antigénique chimérique ou CAR, qui cible un antigène spécifique de la tumeur.
La cytokine interleukine-2 dans le milieu favorise sélectivement la prolifération des lymphocytes T tandis que les autres cellules finissent par mourir.
Transférez le mélange dans une microplaque recouverte de fragments de fibronectine recombinante.
Centrifuger pour faciliter la liaison des fragments de fibronectine aux vecteurs et aux lymphocytes T, médiant l’interaction virus-cellule hôte, et incuber.
Lors de la fusion de l’enveloppe des vecteurs avec la membrane cellulaire, les enzymes virales transcrivent inversement l’ARN libéré en ADN et l’incorporent dans le génome de l’hôte.
Les lymphocytes T transduits expriment des CAR liés à la surface, constitués d’un fragment variable d’anticorps extracellulaire ciblant l’antigène spécifique de la tumeur et les régions de signalisation intracellulaire pour répondre à l’antigène.
Remettez les cellules en suspension avant de les transférer dans un tube.
Centrifuger pour éliminer le surnageant contenant des virus non internalisés, et remettre les cellules en suspension dans un tampon pour les tests en aval.
Le lendemain de la splénectomie, préparez du PBS contenant 25 microgrammes par millilitre de fragment de fibronectine humaine recombinante ou RHFF et enduisez des plaques de 24 puits non traitées par culture tissulaire en ajoutant 0,5 millilitre de la solution dans chaque puits. Le lendemain, retirez la solution des puits et ajoutez 1 millilitre par puits de BSA à 2 % dans du PBS.
Incuber à température ambiante pendant 30 minutes, puis, retirer le BSA en renversant fermement la plaque avant d’ajouter 2 millilitres de PBS à laver. Après avoir recueilli le surnageant viral dans les cellules HEK293T, ajoutez de la MTC fraîche à un volume final en millilitres égal au nombre de puits enrobés de RHFF plus 3 millilitres supplémentaires.
Retirez les splénocytes cultivés de l’incubateur et remettez-les en suspension en pipetant doucement de haut en bas deux à trois fois dans chaque puits. Transférez les suspensions cellulaires dans un tube conique de 50 millilitres. Ensuite, réinstallez les splénocytes dans le surnageant viral à 1 x 106 cellules par millilitre.
Ensuite, ajoutez 1 millilitre par puits de suspension de splénocytes dans les puits des plaques recouvertes de RHFF. Maintenant, faites tourner les plaques pendant 90 minutes à 32 degrés Celsius et 770 gs avec une accélération de 4 et une pause de zéro. Pendant la rotation, préparez 50 unités internationales par millilitre d’IL-2 humaine recombinante dans la MTC.
Après l’essorage, ajoutez 1 millilitre de milieu dans chaque puits des assiettes et incubez toute la nuit. Si les lymphocytes T atteignent plus de 80 % de confluence, divisez les cellules en pipetant doucement de haut en bas dans chaque puits, deux à trois fois, puis transférez 1 millilitre de chaque puits dans de nouveaux puits d’une plaque fraîche de 24 puits traitée pour culture tissulaire.
Ajoutez 1 millilitre de TCM frais, avec 50 unités internationales par millilitre d’IL-2 dans chaque puits. Si les cellules n’atteignent pas plus de 80 % de confluence, changez la moitié du milieu en pipetant lentement 1 millilitre de milieu du haut de chaque puits et en le remplaçant par 1 millilitre de TCM frais, contenant 50 unités internationales par millilitre d’IL-2 humaine recombinante.
Remettez en suspension les cellules CAR-T en les pipetant doucement trois fois dans chaque puits, puis transférez-les dans un tube à centrifuger de 250 millilitres. Faites tourner les cellules à 300 gpendant 10 minutes. Ensuite, aspirez complètement le surnageant sans déranger la pastille. Utilisez du PBS pour laver les cellules, puis comptez-les avant de les laver une deuxième fois. Un rendement typique de cellules CAR-T est d’environ 1 x 106 cellules par puits.