Modification génétique des cellules CAR-T à l’aide d’un système CRISPR-Cas9

Commencez par une suspension de lymphocytes T et traitez-les avec des lentivirus CAR porteurs d’un gène pour le récepteur antigénique chimérique ou des lentivirus CAR et CRISPR.

Le lentivirus CRISPR contient des gènes pour l’ARN guide et la nucléase Cas9 ainsi qu’un gène de résistance aux antibiotiques.

Les lentivirus CAR et CRISPR interagissent avec les lymphocytes T et libèrent leur ARN.

Ces ARN sont retranscrits et convertis en ADN correspondant, qui s’intègre dans l’ADN des lymphocytes T.

Cela permet la synthèse des protéines CAR, des ARN guides et des protéines Cas9.

L’ARN guide forme un complexe avec Cas9, qui reconnaît et se lie spécifiquement au gène cible sur l’ADN des lymphocytes T.

Pendant ce temps, Cas9 clive l’ADN, créant une cassure double brin.

Cette cassure est réparée par l’assemblage d’extrémités non homologues, un mécanisme de réparation sujet aux erreurs, entraînant une modification du gène cible.

Cela génère des lymphocytes T génétiquement modifiés avec des récepteurs antigéniques chimériques.

Traitez les cellules avec des antibiotiques pour éliminer les cellules T non modifiées et isolez sélectivement les cellules CAR-T génétiquement modifiées.

Pour perturber le facteur de stimulation des colonies de granulocytes et de macrophages, utilisez un ARN guide, comme décrit dans le manuscrit. Incuber les réactifs de transfection à température ambiante pendant 30 minutes. Après l’incubation, ajoutez-les aux cellules 293T qui ont atteint une confluence de 70 % à 90 %, et cultivez les cellules transfectées à 37 degrés Celsius, 5 % de CO₂ pour produire un lentivirus.

À 24 et 48 heures, récolter et concentrer le surnageant contenant le virus par ultracentrifugation dans des tubes d’ultracentrifugation de 50 millilitres, et congeler à moins 80 degrés Celsius pour une utilisation future. Puis, le premier jour, remettez doucement les lymphocytes T en suspension pour briser les rosettes.

Dans un laboratoire approuvé BSL-2 plus, pour générer des cellules CAR-T, ajoutez le lentivirus CAR19 et le lentivirus CRISPR ciblant le GM-CSF aux cellules T stimulées. Le troisième et le cinquième jour, pour les lymphocytes T modifiés par lenti-CRISPR et résistants à la puromycine, traitez les cellules avec du dichlorhydrate de puromycine à une concentration de 1 microgramme de puromycine par millilitre.