Une technique CRISPR-Cas9 pour l’édition de gènes dans les lymphocytes T

Prenez des lymphocytes T en suspension dans un milieu adapté à l’électroporation, un processus dans lequel des impulsions électriques créent des pores temporaires dans la membrane cellulaire.

Ajoutez des complexes contenant une protéine Cas9 et un seul ARN guide ou ARNsg. L’ARNsg est un petit ARN qui dirige Cas9, un ciseau moléculaire, vers un emplacement spécifique de l’ADN pour la coupe.

Ajoutez de courtes molécules d’ADN simple brin qui aident à transporter les complexes Cas9-sgRNA dans la cellule.

Transférez ce mélange dans une cuvette et lancez l’électroporation en appliquant de brèves impulsions électriques.

Ce processus permet aux complexes d’entrer dans la cellule.

L’ARNsg se lie au site cible dans l’ADN des lymphocytes T, ce qui permet à Cas9 de modifier l’ADN, créant ainsi une rupture dans les deux brins.

Cette perturbation signale aux protéines de réparation le site.

Les protéines de réparation reconnectent ensuite les extrémités, rendant le gène non fonctionnel.

Incuber les lymphocytes T génétiquement modifiés dans un milieu approprié pour les tests en aval.

Préparez la ribonucléoprotéine, ou complexe RNP, en incubant 10 microgrammes de nucléase Cas9 avec 5 microgrammes d’ARN guide unique pendant 10 minutes à température ambiante. Inclure un contrôle fictif sans ARN guide unique. Combinez les lymphocytes T remis en suspension avec le complexe RNP et ajoutez 4,2 microlitres d’amplificateur d’électroporation à 4 micromolaires. Bien mélanger et transférer dans des cuvettes d’électroporation.

Galvaniser les cellules à l’aide du code d’impulsion EH-1-11. Ensuite, incubez 5 millions de cellules par millilitre de R-10, complétées par cinq nanogrammes par millilitre d’IL-7 humaine et d’Il-15 humaine à 30 degrés Celsius pendant 48 heures dans des plaques à 12 puits. Après l’incubation, procédez à l’activation et à l’expansion des lymphocytes T.