Encyclopédie des expériences JoVE
Immunologie
0 vues • 2:30 min • July 8th, 2025
Prenez des lymphocytes T en suspension dans un milieu adapté à l’électroporation, un processus dans lequel des impulsions électriques créent des pores temporaires dans la membrane cellulaire.
Ajoutez des complexes contenant une protéine Cas9 et un seul ARN guide ou ARNsg. L’ARNsg est un petit ARN qui dirige Cas9, un ciseau moléculaire, vers un emplacement spécifique de l’ADN pour la coupe.
Ajoutez de courtes molécules d’ADN simple brin qui aident à transporter les complexes Cas9-sgRNA dans la cellule.
Transférez ce mélange dans une cuvette et lancez l’électroporation en appliquant de brèves impulsions électriques.
Ce processus permet aux complexes d’entrer dans la cellule.
L’ARNsg se lie au site cible dans l’ADN des lymphocytes T, ce qui permet à Cas9 de modifier l’ADN, créant ainsi une rupture dans les deux brins.
Cette perturbation signale aux protéines de réparation le site.
Les protéines de réparation reconnectent ensuite les extrémités, rendant le gène non fonctionnel.
Incuber les lymphocytes T génétiquement modifiés dans un milieu approprié pour les tests en aval.
Préparez la ribonucléoprotéine, ou complexe RNP, en incubant 10 microgrammes de nucléase Cas9 avec 5 microgrammes
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