Une technique d’édition génomique dans des cellules tueuses naturelles à l’aide de CRISPR Cas9

Prenez un mélange d’un ARN CRISPR, ou ARNcr, et d’un ARNcr ou ARNcr trans-activateur.

Chauffez le mélange et laissez-le refroidir, facilitant ainsi l’appariement de la base de l’ARNtracr avec l’ARNcr pour former un ARN guide, ou ARNg.

Ajoutez des ciseaux moléculaires appelés enzymes Cas9 qui se lient à l’ARNg, créant ainsi des complexes.

Ajoutez les complexes Cas9-gRNA à des cellules Natural Killer ou NK en suspension dans une solution d’électroporation.

Introduire des molécules d’ADN simple brin qui aident au transport des complexes Cas9-gRNA.

Transférez le mélange dans une cuvette et effectuez une électroporation, créant des pores temporaires dans la membrane pour que les complexes pénètrent dans la cellule.

L’ARNg se lie au site cible du génome, ce qui permet à Cas9 de cliver l’ADN.

Les protéines de réparation se lient au site de la rupture et rejoignent l’ADN, provoquant souvent des erreurs d’insertion ou de suppression de paires de bases. La modification qui en résulte perturbe le gène cible, le rendant non fonctionnel.

Transférez les cellules génétiquement modifiées dans un milieu approprié pour une analyse plus approfondie.

Le jour de l’électroporation, remplissez un flacon T25 avec 8 millilitres de milieu de culture frais complété par 100 UI par millilitre d’IL-2 par condition de cellule expérimentale, et placez les flacons dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et à 5 % de CO₂.

Pendant que le milieu s’équilibre, ajoutez 3 à 4 x 10⁶ cellules par condition, par 26 microlitres de mélange de transduction dans un tube conique, et granulez les cellules par centrifugation. Ensuite, lavez les cellules trois fois dans 12 millilitres de PBS stérile par lavage pour éliminer tout le FBS des suspensions cellulaires.

Pendant que les cellules sont lavées, remettez en suspension chaque ARN CRISPR et ARN traceur à 200 concentrations finales micromolaires. Mélangez 2,2 microlitres de chaque ARN CRISPR avec un volume de 200 micromolaires d’ARN traceur par échantillon et chauffez les échantillons à 95 degrés Celsius pendant 5 minutes. Ensuite, laissez les échantillons refroidir à température ambiante et stockez les complexes ARN CRISPR - ARN traceur à moins 20 degrés Celsius jusqu’à leur utilisation.

Pour former les complexes ribonucléoprotéiques, ajoutez l’endonucléase Cas9 au complexe ARN CRISPR - ARN traceur correspondant en tourbillonnant pendant 30 à 60 secondes, et incubez les complexes ribonucléoprotéiques Cas9 résultants à température ambiante pendant 15 à 20 minutes.

Après le dernier lavage, ajoutez tout le volume de supplément d’électroporation du kit P3 de la solution Nucleofector et remettez en suspension chaque pastille de cellule dans 20 microlitres de la solution primaire 4D-Nucleofector P3, en prenant soin d’éviter les bulles d’air.

Ajoutez immédiatement 5 microlitres de chaque complexe ribonucléoprotéique à la suspension cellulaire appropriée, et ajoutez 1 microlitre d’amplificateur d’électroporation Cas9 de 100 micromolaires au mélange cellulaire du complexe ribonucléoprotéique Cas9. Transférez 26 microlitres de la solution cellulaire de ribonucléoprotéine Cas9 dans les puits individuels d’une bandelette Nucleocuvette, et tapotez doucement la bande pour vous assurer que les échantillons couvrent le fond de chaque puits.

Ensuite, démarrez le programme du système 4D-Nucleofector EN-138. À la fin de la transduction, laissez les cellules se reposer pendant trois minutes. Ensuite, ajoutez 80 microlitres de milieu de culture pré-équilibré dans chaque cuvette et transférez doucement les échantillons dans un flacon par condition à 37 degrés Celsius d’incubation.