Génération de virus grippaux vivants atténués recombinants pour les vaccins

Commencer avec des plasmides bidirectionnels portant de l’ADNc codant pour certaines protéines essentielles virales d’une souche de grippe adaptée au froid.

Introduire un nouvel ensemble de plasmides bidirectionnels contenant de l’hémagglutinine et de l’ADNc neuraminidase modifié d’une souche de grippe différente.

Introduisez un réactif de transfection dans ce mélange et incubez pour former un complexe avec les plasmides.

Transférez ces complexes sur des cellules épithéliales humaines en culture pour permettre l’entrée du plasmide dans la cellule.

Les plasmides bidirectionnels avec deux promoteurs dans des orientations opposées permettent la production de protéines virales et de leur ARN correspondant.

Incuber les cellules à une température plus basse.

Les protéines virales et les ARN viraux s’auto-assemblent pour former des virus grippaux recombinants adaptés au froid avec une réplication réduite dans des conditions plus chaudes.

Superposition avec des cellules MDCK surexprimant l’acide sialique et des enzymes trypsine modifiées qui permettent la fixation et l’entrée virales à l’intérieur des cellules.

Incuber à la même température pour induire la réplication et la production de nouveaux virus.

Centrifuger et récolter les virus grippaux vivants atténués recombinants prêts à être préparés pour un vaccin.

Pour commencer, plaquez un million de cellules 293T dans chaque puits d’une plaque à 6 puits avec du DMEM contenant 10 % de sérum bovin fœtal et 1 % de streptocoque de stylo. Ensuite, préparez suffisamment de mélange de transfection plasmidique pour 100 microlitres par puits. Combinez un microgramme de chaque plasmide et remplissez le tube avec un milieu cellulaire Opti-MEM préchauffé à 50 microlitres. Dans un autre tube, ajoutez deux fois le volume de lipofectamine 2000 correspondant à la quantité totale de plasmide à transfecter, et complétez le tube à 50 microlitres avec Opti-MEM.

Avant d’ajouter le mélange de transfection dans les cellules, laissez-le reposer pendant 30 minutes à température ambiante. Ensuite, ajoutez 100 microlitres du mélange de transfection dans chaque puits et déplacez la plaque dans un incubateur pendant 16 heures. Le lendemain, changez le milieu en DMEM avec 0,3 % de BSA et 1 % de streptocoque. Alors. déplacez les cellules à 33 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant cinq heures.

Après cinq heures, ajoutez une superposition d’un million de cellules MDCK permissives à la grippe dans du DMEM supplémenté en trypsine. Maintenez les co-cultures pendant 2 à 3 jours sous le régime d’incubation de 33 degrés Celsius pour générer et amplifier le virus. Plus tard, nettoyez les débris à l’aide d’une rotation de cinq minutes de 260 g, puis récupérez les surnageants.