JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 vues • 2:55 min • July 8th, 2025
Prenez une plaque multi-puits contenant des cellules tueuses naturelles, ou NK, et des cellules cancéreuses. Les puits de contrôle ne contiennent que des cellules cancéreuses.
Centrifugeuse pour faciliter le contact cellulaire.
couver. Les récepteurs activateurs des cellules NK se lient aux ligands de surface des cellules cancéreuses, ce qui déclenche la libération de granules contenant des molécules cytotoxiques.
Ces molécules créent des pores de membrane cellulaire cancéreuse et induisent l’apoptose, libérant du contenu intracellulaire, y compris la lactate déshydrogénase, ou LDH.
Ajoutez un détergent pour lyser les cellules cancéreuses dans les puits de contrôle pour une libération maximale de LDH.
Centrifuger et transférer une partie des surnageants contenant de la LDH dans une plaque de dosage.
Ajouter le réactif de dosage et incuber.
La LDH convertit le lactate en pyruvate, réduisant le NAD+. La diaphorase utilise le NADH pour réduire le sel de tétrazolium, formant un produit de formazan de couleur rouge.
Ajoutez une solution acide pour arrêter la réaction enzymatique.
Utilisez un lecteur de microplaques pour mesurer l’absorbance du formazan dans les puits.
L’intensité du formazan est proportionnelle au nombre de cellules cancéreuses lysées dans le puits d’essai, ce qui indique la cytotoxicité des cellules NK contre les cellules cancéreuses.
Tout d’abord, procurez-vous une plaque à 96 puits traitée par culture à fond rond et installez-la comme indiqué dans le tableau 1 du protocole de texte. Centrifugez la plaque de dosage à 250 fois g pendant 4 minutes pour vous assurer que l’effecteur et les cellules cibles sont en contact. Ensuite, incubez la plaque dans une chambre humidifiée à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 5 heures.
45 minutes avant de récolter les surnageants, ajoutez 10 microlitres de solution de lyse 10x dans les puits de libération maximale de LDH de la cellule cible, et retournez la plaque dans la chambre humidifiée. Lorsque l’incubation est terminée, centrifugez la plaque à 250 fois g pendant 4 minutes. Ensuite, utilisez une pipette multicanaux pour transférer des aliquotes de 50 microlitres de chaque puits vers une plaque de dosage à fond plat fraîche de 96 puits.
Ajoutez 50 microlitres de réactif de test dans chaque puits de la plaque de test. Couvrez l’assiette d’une feuille d’aluminium pour la protéger de la lumière et incubez à température ambiante pendant 30 minutes. Après cela, ajoutez 50 microlitres de solution d’arrêt dans chaque puits. Assurez-vous de lire la plaque dans l’heure suivant l’ajout de la solution d’arrêt et d’enregistrer l’absorbance à 490 nanomètres.